滋肾阴、温肾阳颗粒及关键药对防治原发性骨质疏松症“病证结合”新药创制研究＊

赵东峰，舒 冰，唐德志，张 岩，赵永见，李晨光，王 强，梁倩倩，崔学军，杨燕萍，徐 浩，施 杞，王拥军,4＊＊

（1.上海中医药大学附属龙华医院 上海 200032；2.上海中医药大学脊柱病研究所 上海 200032；3.教育部筋骨理论与治法重点实验室 上海 200032；4.上海中医药大学康复医学院 上海 200032）

原发性骨质疏松症（Primary osteoporosis，POP）临床表现为骨痛、腰背痛和驼背等症状[1]。由于患者骨骼系统的脆性增加，轻微外力作用下轻易造成骨折，对健康造成威胁。全球目前约有2亿患者，美国、欧洲和日本大约有7 500万人罹患此病[2]。随着老年社会的到来，中国POP的发病率也逐渐升高。在60-64岁妇女人群，POP发生率为53.8%，而在65-69岁人群发生率达到70%，患者并发症骨折的发生率分别为27.5%和32.6%[3]，对患者和家人造成巨大的危害。因此，针对POP治疗开发更加安全有效、价格低廉的药物成为未来应对POP的重要策略。

补肾益精法是中医药治疗POP的重要法则，前期临床实践和基础研究[4,5]发现，肾主导人体骨的生长、发育、强劲、衰弱，尤其是骨与人体肾精盛衰的关系密切。《黄帝内经·素问》：“肾主骨，生髓”、“肾，其充在骨”。《医精经义·中卷》曰“骨内有髓、骨者髓所生……肾藏精、精生髓，故骨者，肾之所合也”，强调肾精决定人体骨骼的状态。根据中医治疗POP病症结合的原则，辨证论治也存在温肾阳、滋肾阴治法的区别[6,7]，临床根据肾阴虚、肾阳虚症状的区别和侧重，治疗时分别应用滋肾阴和温肾阳法给予施治。

本项目组通过大样本临床流行病学调查，验证了病证结合防治POP分子流行病学规律。在国家“973”计划项目、国家教育部“创新团队”计划项目、国家科技部重点领域“创新团队”计划项目等大力支持下，完成了中国华东、华北、东南、东北、西北城市人口地区完成6 447例POP“证病结合”临床流行病学调查，证明POP患者多出现倦怠乏力、骨骼疼痛、腰膝酸软、畏寒肢冷、下肢抽筋、齿摇发脱等“肾精亏虚”表现，且频次较高，约占83%，其中“肾阳虚证”34%，“肾阴虚证”49%，上述研究明确了“肾精亏虚”是POP主要证候[8]。

“病症结合”是治疗POP重要策略，滋肾阴和温肾阳法则是体现“肾精亏虚”和“病症结合”的法则的重要体现[5]。在此研究基础上，本项目组通过分析施杞教授治疗POP的2 646张处方，创制出新型制剂滋肾阴颗粒和温肾阳颗粒，临床取得较好的效果。下文将从病证结合防治POP临床试验研究验证、病证结合防治POP基础实验研究、病证结合防治POP的中医理论综合分析等方面进行描述。

1 温肾阳、滋肾阴颗粒防治POP的分子流行病学研究

上海中医药大学附属龙华医院骨伤科团队设计了滋肾阴、温肾阳颗粒治疗POP的多中心、双盲、安慰剂对照结合中医证型设计的随机对照研究[9]。研究中POP患者来源于四个中心（上海中医药大学附属龙华医院、复旦大学附属华东医院、上海市杨浦区中心医院、西安市红十字会医院4个中心，时间：2011.02-2012.04）的POP患者。中医辨证属肾虚的患者200例，患者随机化分组法先进行中心分层，然后进行中医证型分层，滋肾阴颗粒试验组和安慰剂对照组各50例，温肾阳颗粒试验组与安慰剂对照组分别为50例，共计200例，比例分配1∶1，试验组和对照组各100例。观察指标包括骨密度、疼痛（Visual Analogue Scale）VAS评分、中医证候积分、ECOS-16生活质量问卷及安全性指标。时间点为治疗前、治疗3月、治疗6月、停药3个月和停药6个月。

研究结果发现与安慰剂比较，滋肾阴颗粒治疗6月可显著增加腰椎骨密度（P＜0.05），增加幅度为4.1%。停药后随访6月还可增加腰椎骨密度，增加幅度为4.7%；与安慰剂比较，温肾阳颗粒治疗后可显著降低疼痛程度VAS评分而改善疼痛（P＜0.05），明显改善中医证候，并能显著降低ECOS-16评分而改善生活质量（P＜0.05）。且整个研究过程中没有发现严重不良反应。该研究证明滋肾阴颗粒、温肾阳颗粒是一种有效、安全的POP治疗方法，可以显著提高POP腰椎骨密度，减轻疼痛，改善中医证候，提高患者生活质量。同时，证明滋肾阴颗粒能明显提高患者腰椎骨密度，改善肾阴虚证候；温肾阳方能明显改善肾阳虚证候和生活质量。

2 温肾阳、滋肾阴颗粒防治POP的药对研究

蛇床子、女贞子分别是滋肾阴颗粒和温肾阳颗粒的主要药物（君药），分别具有滋补肝肾阴和温肾壮阳的作用，其中两者的中药配伍目的是达到“阴中求阳”、“阳中求阴”的效果[10]。药对是中医临床遣药组方最基本的配伍形式，药对的合理组方能起到增效减毒的作用。滋肾阴颗粒和温肾阳颗粒配伍和组方中蕴含药对的内涵。因此，药物研制过程中分别用女贞子（滋肾阴颗粒）、蛇床子（温肾阳颗粒）药对进行相关的基础研究。

按照药剂量的差异，设置3组，分别体现阳中求阴、阴阳并调和阴中求阳等3个差异，分别设置为A组：蛇床子12 g、女贞子6 g（阳中求阴），B组：蛇床子9 g、女贞子9 g（阴阳平衡），C组：蛇床子6 g、女贞子12 g（阴中求阳）。上述药对灌胃干预去卵巢诱导的POP小鼠模型。结果显示蛇床子-女贞子药对能够缓解去卵巢小鼠腰椎骨量丢失，同时改善改善骨小梁结构。随后应用有效组分进行细胞水平的机制研究。分别应用小鼠的原代间充质干细胞和造血干细胞，证明温肾阳、滋肾阴颗粒中药物有效组分蛇床子素（蛇床子）、女贞苷（女贞子）分别调节Wnt/β-catenin通路，促进OPG表达，抑制破骨细胞形成。同时，蛇床子素能够刺激成骨细胞的分化[11,12]。

3 病证结合防治POP基础实验研究

滋肾阴颗粒和温肾阳颗粒有效组分研究对阐述药物在分子水平的作用具有重要意义。团队应用滋肾阴颗粒、温肾阳颗粒有效组分建立了“中药防治骨质疏松症体外筛选系统”以及“补肾益精中药有效组分库”。筛选出补肾益精中药及有效组分骨碎补总黄酮、淫羊藿苷、补骨脂素、蛇床子素能够显著增加成骨细胞中骨发生形态蛋白的表达[13-18]。利用Wnt/β-Catenin、BMP2/4/7、OPG基因敲除小鼠和去卵巢大鼠模型，建立了“补肾益精中药防治骨质疏松症体内筛选系统”。证明了温肾阳、滋肾阴颗粒及其有效组分[13-18]，如骨碎补总黄酮、淫羊藿苷、补骨脂素、蛇床子素、齐墩果酸能够促进骨生成，增加骨量。另一个方面，通过抑制骨吸收而抑制骨丢失。

基础实验研究上，通过选择典型的信号途径为研究切入点，阐明补滋肾阴颗粒和温肾阳颗粒调控骨代谢的分子机制。滋肾阴颗粒和温肾阳颗粒中药及有效组分通过系统调控Wnt/β-Catenin和RANKL/RANK/OPG信号通路的表达，分别调控骨生成和骨吸收的平衡，发挥“系统调节骨代谢平衡”的作用。具体而言，明确了温肾阳颗粒和滋肾阴颗粒通过上调Wnt/β-Catenin信号通路，促进骨髓间充干细胞成骨分化，促进骨生成；同时，可以间接调节RANKL/RANK/OPG信号轴活性从而调控造血干细胞向破骨细胞分化，抑制骨吸收[13-17]，其中淫羊藿苷、骨碎补总黄酮上调β-Catenin信号通路，补骨脂素上调BMP信号通路。蛇床子素上调成骨细胞中β-Catenin信号转导通路，抑制RANK相关信号通路的活性[18]。

图1 “病证结合、调和肾阴肾阳”理论指导下滋肾颗粒和温肾阳颗粒防治原发性骨质疏松症的新药创制流程

4 温肾阳、滋肾阴颗粒防治POP的系统调控作用

滋肾阴颗粒、温肾阳颗粒分别体现补肾益精法中“阳中求阴”和“阴中求阳”的法则，其作用体现出阴阳并调的生理作用。具体而言，在骨骼系统，分别刺激骨生成和抑制骨吸收；在细胞水平[19]，分别发挥刺激成骨细胞的分化和功能，另外系统调控作用是抑制破骨细胞的功能；整体而言，其机制类似于恢复人体的阴阳动态的平衡；对于POP患者而言，就是在骨重建内恢复成骨细胞和破骨细胞的平衡[10]。

在刺激成骨细胞分化的骨生成方面，滋肾阴颗粒和温肾阳颗粒能够刺激对间充干细胞诱导的成骨细胞的分化，其分子机制与其能够调控Notch信号途径的表达有关[20]。分别调控间骨髓充质干细向成骨细胞的分化，同时促进去分泌骨生成相关因子的表达。滋肾阴颗粒和温肾阳颗粒对破骨细胞的调控主要体现在3个方面：其一，补肾中药调控破骨细胞的分化和生成；其二，补肾中药能够抑制破骨细胞的骨吸收功能；其三，补肾中药能够维持骨吸收和骨生成之间的平衡，维持骨稳态。综合目前研究发现，滋肾阴颗粒、温肾阳颗粒能够调控骨生成和骨吸收之间的平衡，临床治疗能够增加POP患者的骨密度和改善患者症状。

5 讨论

滋肾阴颗粒、温肾阳颗粒的药物研制是中医基础理论、辨证论治、临床流行病学和分子生物学等学科综合努力的成果，体现临床转化的转化医学思想。两者的开发分别从中辨证论治和病症结合指导，从临床流行病学调查、辨证论治、临床RCT验证、疾病动物模型、药对研究验证和有效组分分子机制研究。研究模型涉及临床患者（中医理论指导）、动物模型、骨骼系统、多能干细胞、骨细胞等水平，全面验证药物的作用机制，是临床与基础研究比较成功的研究案例（见图1）。综合前期研究，滋肾阴颗粒、温肾阳颗粒的开发从四个方面的进行阐述：病证结合防治POP分子流行病学规律；病证结合防治POP临床试验研究验证；病证结合防治POP基础实验研究机制病证结合防治POP；中医理论综合分析。其研究的优势在于将中医理论和临床结合起来，发现中医药治疗POP的系统调控作用。在揭示滋肾阴颗粒、温肾阳颗粒治疗POP机制的同时，也阐明中医药系统调控骨骼系统的特征。

中医学认为人体的阴阳平衡是维持健康的因素，中医药作用于人体的机制在于恢复人体的稳态。促使人体亢奋的功能得到抑制，而低下的更能得到提升。对于POP而言，破骨细胞主导的骨吸收超过成骨细胞所主导的骨生成是其基本病理改变[20]。因此，药物能够抑制骨吸收或者刺激骨生成均能够用来治疗POP[22,23]。目前为止，临床的药物大多抑制骨吸收或者刺激骨生成，而能够同时调控骨吸收和骨生成的药物相对缺少。按照POP的基本病理改变，滋肾阴颗粒、温肾阳颗粒能够发挥系统调控的作用，既能够增加骨生成，也能够抑制骨吸收，理论而言能够增强临床治疗POP的效果；另外滋肾阴颗粒、温肾阳颗粒的优势是降低副作用，因为大多数通过抑制骨吸收治疗POP的药物存在各种各样的副作用[24,25]。因此，滋肾阴颗粒、温肾阳颗粒治疗POP的优势在于系统调控，同时其优势在于副作用较小。

但是，滋肾阴颗粒、温肾阳颗粒药物研究还需要解决下面的问题：一、温肾阳和滋肾阴颗粒均能够治疗POP，两者存在共同之处，但是两者有无差别？差别体现在何处？二、温肾阳和滋肾阴颗粒均能够刺激骨生成、抑制骨吸收，发挥系统调控作用，但是两者差异能否在刺激骨生成、抑制骨吸收的体现出来？为何中医又强调滋肾阴和温肾阳的区别？三、两者对成骨细胞和破骨细胞作用有无差异？这能否是温肾阳和滋肾阴差异的物质基础？虽然，前期研究我们发现温肾阳颗粒改善POP患者症状突出，如疼痛和生活质量。而滋肾阴颗粒延缓骨丢失症状明显，如骨密度，但是这些区别是否真正的存在，还需要在未来的药物机制研究、药理学和临床研究中加以验证。因此，后续研究要寻找两者的共同之处，同时要寻找两者差异之处，并阐述其共性和个性的机制。

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