缬草醛对肠易激综合征模型大鼠结肠CRF，TPH1 mRNA及5—HT表达的影响

陶丝雨+肖丛瑞+王晶+张淑静+高誉珊+穆芳园+王一程+闫兴丽

[摘要]该研究旨在通过探讨蜘蛛香环烯醚萜类成分缬草醛对肠易激综合征（IBS）大鼠结肠中促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）、色氨酸羟化酶1（TPH1） mRNA表達及5羟色胺（5HT）含量的影响，阐释缬草醛通过5HT通路治疗IBS的作用机制。将54只SD 雄性大鼠随机分为空白对照组、模型组、缬草醛高、中、低剂量组、匹维溴铵组，每组9只。采用孤养结合慢急性不可预见性应激法建立IBS大鼠模型，免疫组化法测定大鼠结肠CRF表达，RTPCR法测定结肠中TPH1 mRNA表达，高效液相色谱法测定大鼠结肠中5HT含量。实验结果显示，孤养结合慢急性不可预见性应激可造成大鼠结肠中CRF，TPH1 mRNA表达以及5HT含量升高（P<005），缬草醛各剂量组中CRF，TPH1 mRNA及5HT含量较模型组明显下降（P<005）。实验结果表明，肠易激综合征能够导致结肠中CRF，TPH1 mRNA的表达以及5HT的含量升高，而缬草醛通过降低结肠中CRF，TPH1 mRNA的表达以及5HT的含量，而改善胃肠道的相关症状。

[关键词]缬草醛； 肠易激综合征； 促肾上腺皮质激素释放因子； 色氨酸羟化酶1； 5羟色胺

Effects of baldrinal of Valeriana jatamansi on expression of CRF，

TPH1 mRNA and 5HT in rats with irritable bowel syndrome

TAO Siyu 1， XIAO Congrui 2， WANG Jing 2， ZHANG Shujing1， GAO Yushan1，

MU Fangyuan1， WANG Yicheng1， YAN Xingli1*

（1. School of Preclinical Medicine， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100029， China；

2. School of Chinese Materia Medica， Beijing University of Chinese Medicine， Beijing 100102， China）

[Abstract]This study aimed to investigate the effects of baldrinal of Valeriana jatamansi on the expression of corticotropin releasing factor （CRF） and tryptophan hydroxylase 1 （TPH1） mRNA and levels of 5hydroxytryptamine （5HT） in colon of rats with irritable bowel syndrome （IBS）， and to explain its therapeutic mechanism on IBS through 5HT pathway Fiftyfour male SD rats were randomly divided into 6 groups： blank group， model group， baldrinal high， medium and low dose groups， and pinaverium bromide group， n=9 in each group The IBS rat models were established by using unpredictable chronic stress for 3 weeks followed by 1hour acute restraint stress （CAS） after 7 days of rest and independent feeding CRF expression was detected by IHCP； TPH1 mRNA expression was detected by using RTPCR and the 5HT level was measured by high performance liquid chromatography（HPLC） The results indicated that the method of chronic stress with acute restrain stress method and independent feeding could lead to the increase in expressions of CRF and TPH1 mRNA and levels of 5HT in IBS rats（P<005） The expressions of CRF， TPH1 mRNA and 5HT in baldrinal groups were significantly lower than those in model group（P<005） The experimental results showed that IBS could result in increase in the expressions of CRF， TPH1 mRNA and levels of 5HT， and the baldrinal of V jatamansi could improve the symptoms of IBS by reducing the expressions of CRF， TPH1 mRNA and levels of 5HT in colon of rats

[Key words]baldrinal； IBS； CRF； TPH1； 5HT

肠易激综合征（irritable bowel syndrome，IBS） 是一种临床常见的胃肠功能紊乱性疾病，以腹痛、腹泻、排便习惯和排便性状异常为主要癥状，持续存在或间歇发作，而无形态学和生化异常改变的症候群[1]。IBS发病机制尚未完全明确，目前普遍认为内脏敏感性和肠道动力异常是IBS特征性的病理生理学基础[2]。5羟色胺（5HT）含量的改变与IBS患者腹痛、腹泻及内脏敏感等症状密切相关。

蜘蛛香Valeriano jatamansi Jones为败酱科缬草属植物，常用于治疗脘腹胀痛，消化不良，腹泻等疾病。课题组前期研究发现，蜘蛛香原粉[3]以及蜘蛛香环烯醚萜类成分11ethoxyviburtinal具有止泻作用，并且可以通过降低结肠中5HT含量，改善IBS 模型大鼠的肠道功能紊乱[45]；同时降低结肠中P物质、血管活性肽和生长抑制素等胃肠激素的分泌水平[6]，抑制结肠嗜铬细胞（EC）和肥大细胞（MC）的表达[7]，降低内脏敏感性，缓解IBS模型大鼠的症状。本实验通过研究蜘蛛香另一环烯醚萜类成分缬草醛（baldrinal）对IBS模型大鼠结肠中与5HT合成相关的促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）及色氨酸羟化酶1（TPH1）的表达水平及5HT含量的影响，阐释缬草醛治疗IBS的作用机制。

1材料

11动物SD大鼠，体重120～140 g，雄性。北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）20150001。动物于20～24 ℃，湿度60%～70%，12 h明暗的环境中适应性饲养3 d后开始实验。

12试剂免疫组化超敏SP试剂盒（兔、KIT9706）、DAB显色试剂盒（DAB0031）：福建迈新生物技术开发有限公司；AntiCorticotropin Releasing Factor antibody（ab8901）：美国Abcam公司。Trizol（98903）：ambion；三氯甲烷（20120704）、异丙醇（20140417）：北京化工厂；反转录cDNA试剂盒（00322404）、Power SYBR Green PCR Master Mix（1511510）：Thermo Scientific。5HT（028K1582）：SIGMA；柠檬酸（051024）、乙二胺四乙酸二钠（990730）：北京化学试剂公司；高氯酸（SHBG2241V）：SIGMAALDRICH。

13仪器1510型石蜡薄片切片机（德国LETIZ公司）；显微镜及分析系统（日本尼康公司）；液相色谱仪（Waters e2695）；电化学检测器（Waters 2465）；C18柱（Waters，21 mm×150 mm，3 μm，Lot No：0159341691）；实时荧光定量PCR系统（Applied BiosystemsTM）；温度梯度PCR仪（美国伯乐BioRad）；UV2600（A）紫外可见分光光度计（尤尼柯）。

14药物蜘蛛香环烯醚萜类成分缬草醛：取适量缬草醛（缬草醛从蜘蛛香药材中提取分离得到，由北京中医药大学中药化学系提供），用蒸馏水配制成所需剂量的混悬液。缬草醛高、中、低剂量分别为06，03，015 mg·kg-1。其中缬草醛中剂量相当于人临床等效量[8]。阳性药物：得舒特（匹维溴铵片）：Abbott Products SAS，批号637753。用蒸馏水配制成所需剂量的混悬液，灌胃给药量为25 mg·kg-1。给药剂量相当于人临床等效量（为人用剂量的7 倍）[9]。

2方法

21肠易激综合征大鼠模型的制备及给药SD雄性大鼠54只，按照随机分组原则分为空白对照组、IBS模型组、缬草醛高、中、低剂量组、匹维溴铵组，每组9只。空白对照组不加任何刺激。其余各组的大鼠每笼1只孤养，60 d内随机循环接收7种不同慢性刺激：①断水（24 h）；②断食（24 h）；③昼夜颠倒；④冷水刺激（4 ℃，5 min）；⑤潮湿饲养（24 h）；⑥夹尾致痛（1 min）；⑦束缚制动（5 h）。同时每30 d对大鼠进行急性束缚刺激1 h。各给药组自实验第33天开始灌胃给药，给药时间：每日上午9时，给药体积为10 mL·kg-1，空白对照组与模型组给予同容量的蒸馏水，总计治疗30 d[10]。

22免疫组化法测定结肠中CRF的表达治疗结束后，给予10%水合氯醛麻醉后开胸，4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液灌注，取肛门上方7cm处结肠，放入4%多聚甲醛固定3 d，脱水、包埋、制蜡块，切片制片后进行免疫组化。

切片常规脱蜡脱水后，PBS冲洗3次（每次3 min）；柠檬酸修复煮沸10 min；冷却至室温后PBS冲洗3次（每次3 min）；H2O2室温封闭10 min；PBS冲洗3次（每次3 min）；滴加正常山羊血清封闭液，室温10 min，甩去多余液体；滴加一抗80 μL，4 ℃过夜；次日PBS冲洗3次（每次5 min）；滴加生物素化二抗，室温10 min；PBS冲洗3次（每次3 min）；滴加生物素化三抗，室温10 min；PBS冲洗3次（每次3 min）；DAB试剂盒显色剂显色，室温10 min（避光）；自来水冲洗3次（每次3 min）；常规脱水脱蜡后中性树胶封片。显微镜观察，记录总积分光密度值（integrated option density，IOD）。

23荧光定量PCR测定结肠中TPH1 mRNA表达[11]治疗结束后，大鼠断头处死，在低温环境中迅速取截取距动物肛门5 cm处结肠1 cm，约100 mg，投入液氮中速冻后于-80 ℃保存。根据GenBank中登录的TPH1和内参βactin基因序列设计引物（由上海英潍捷基公司合成）。TPH1的上游引物为5′GATGGTCAGTCTGGATGCTATG3′，TPH1的下游引物为5′GTCTCCTTGAAGTCTAGTGTGTG3′；βactin上游引物序列为5′ACCGTGAAAAGATGACCCAGAT3′，βactin下游引物序列为5′CCAGAGGCATACAGGGACAA3′。使用Trizol提取结肠组织中总RNA，并以其为模板反转录合成cDNA，再以cDNA为模板PCR扩增TPH1基因。以2 μL cDNA作为模板进行荧光定量PCR扩增。反应条件为：95 ℃预变性10 min。以后95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，40个循环；融解曲线：PCR结束后，95 ℃，15 s，冷却至60 ℃，1 min；60～95 ℃，每升高03 ℃，收集1次荧光信号，最后95 ℃，15 s。

相对表达量（relative qualification，RQ）=2（Ct对照目的基因-Ct对照内参基因）-（Ct处理目的基因-Ct处理内参基因）

24高效液相电化学法测定结肠中5HT的含量[12]治疗结束后，动物断头处死，截取距大鼠肛门5 cm 处结肠1～2 cm，称重后加入3倍体积的01 mol·L-1高氯酸溶液，粉碎后匀浆，离心取上清20 μL进样。色谱条件：流动相缓冲盐甲醇（96∶4）；流速030 mL·min-1；电化学检测器工作电压075 V；进样量20 μL，柱温35 ℃。进样25，5，10，20，40，80 μL求出标准曲线。

25数据统计数据以±s表示，采用SAS82软件进行统计分析。多个样本均数比较用单因素方差分析（OneWay ANOVA），其中方差齐者用LSD法进行组间比较，方差不齐者采用Dunnett′s T3法进行组间比较。以P<005判断差异显著性。

3结果

31缬草醛对IBS模型大鼠结肠CRF表达的影响CRF主要表达在肠黏膜固有层和下层的胞浆中，阳性细胞呈棕褐色。对照组的阳性细胞数量少，着色较浅；IBS模型组的阳性细胞数量较对照组明显增多，着色较重；缬草醛各剂量组及匹维溴铵组的阳性细胞数量较模型组有所减少，着色较浅。各组大鼠的总IOD值均高于对照组（P<005），说明孤养结合慢急性不可预见性刺激的造模方法能够促进大鼠结肠CRF的表达；对照组与缬草醛高剂量组的IOD值低于模型组（P<005），见图1，表1。

陶丝雨等：缬草醛对肠易激综合征模型大鼠结肠CRF，TPH1 mRNA及5HT表达的影响

32缬草醛对IBS模型大鼠结肠TPH1 mRNA表达的影响与对照组比较，IBS模型组大鼠结肠中TPH1 mRNA表达明显增高（P<005），与IBS模型组比较，缬草醛中、低剂量组及匹维溴铵组大鼠结肠中TPH1 mRNA表达下降明显（P<005），见表2。

33缬草醛对IBS模型大鼠结肠5HT含量的影响以峰面积为纵坐标，5HT质量为横坐标，得到标准曲线Y=20 418X+25 941，R2=0996；以峰面积为纵坐标，此方法线性良好，可用于生物样品中5HT含量测定。实验结果见表3，与对照组相比较，模型组5HT含量明显升高（P<005），缬草醛高、中、低剂量组较模型组5HT含量明显下降（P<005）。

4讨论

苗药蜘蛛香是败酱科缬草属植物的根及根茎，曾载《本草纲目》，1977年版和2010年版《中国药典》（一部）中亦有收载。蜘蛛香性味辛、苦、温，用于治疗胃肠道疾病有较好的疗效，如消化不良，呕吐腹泻，小儿疳积、腹胀、食少、胃气痛等[13]。缬草醛（baldrinal）是蜘蛛香中环烯醚萜类降解后的主要成分，结构稳定，提取分离量大[14]。

现代研究表明，IBS的发病机制主要包括内脏感知障碍、胃肠动力异常以及胃肠分泌异常等，5羟色胺（5HT）作为一种具有多种生物功能的广泛存在于中枢神经系统和胃肠道的神经递质，被发现积极参与了上述生理病理过程，并与IBS患者腹痛、腹泻及内脏敏感等症状密切相关[15]。肠道内5HT的增加，会导致肠神经系统（enteric nervous system，ENS）高度敏感，激活多种神经活性物质，导致脑肠轴内信号异常；而5HT还作用于相关受体，导致患者肠道的感知、运动和分泌改变，产生IBS的症状[1617]。

促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）是一种能够介导下丘脑垂体肾上腺轴（HPA轴）产生各种应激反应的关键调节肽。应激可以刺激下丘脑的神经内分泌细胞释放CRF，CRF能够激活肥大细胞，使其脱颗粒释放5HT，改变胃肠动力，提高内脏敏感性。因此，CRF可能通过对5HT表达的调控来影响IBS的内脏敏感性[1820]。

色氨酸羟化酶（TPH）是机体外周系统合成5HT的关键限速酶，TPH1是其主要异构体之一，主要在肠嗜铬细胞（EC）中表达。TPH1可以介导EC细胞重摄取的色氨酸（Trp）分解成为5羟色氨酸（5HTP），进而脱羧生成5HT。因此，TPH1直接影响5HT的生成，其表达的增强会引起5HT水平的升高[21]。应激状态下，CRF与TPH1同时作用，促进5HT的分泌与生成，导致结肠5HT水平的异常升高，从而产生IBS的相关症状[22]。

课题组前期研究发现，慢性应激可以使IBS大鼠5HT分泌增加，EC细胞数量增多，内脏敏感性增加，而束缚应激也可以促进EC细胞释放5HT[2324]。本实验中采用孤养结合慢急性不可預见性应激法制备肠易激综合征大鼠模型[25]，结果表明，IBS模型组大鼠结肠组织中CRF与TPH1表达均显著升高，5HT含量也明显升高，说明5HT含量升高可能与CRF，TPH1表达升高有关，而5HT的异常升高会导致肠道内脏敏感性和肠道动力异常，证明CRF和TPH1的表达异常与IBS的发生有密切关系。给予缬草醛治疗后，缬草醛能够明显降低IBS模型大鼠结肠内5HT的含量，结肠中CRF，TPH1表达较模型组显著下降，说明缬草醛可能是通过降低IBS模型大鼠结肠CRF的表达水平，影响肥大细胞释放5HT；通过调控TPH1影响了5HT的合成，降低了结肠内5HT的含量，从而改善了IBS的相关症状。

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[责任编辑张宁宁]

[收稿日期]20160907

[基金项目]国家自然科学基金项目（81374044）；校级自主课题项目（2016JYBXS028）

[通信作者]*闫兴丽，博士，研究员，研究方向：传统中医药用药规律、作用规律及应用基础研究，Email：xingliyan3@126com

[作者简介]陶丝雨，硕士研究生，Email：siluhuayu9229@163com