microRNA对自然杀伤细胞发育及功能调控的研究进展

刘贝贝，赵 敏

microRNA对自然杀伤细胞发育及功能调控的研究进展

刘贝贝，赵 敏

自然杀伤（natural killer, NK）细胞作为重要的固有免疫细胞，在抗病毒和抗肿瘤机制中发挥重要作用。NK细胞的发育和激活受多种细胞因子和表面受体的调控。目前对NK细胞发育、成熟及功能的研究从转录水平逐渐进展到转录后水平。微小RNA（microRNA, miRNA）作为一种非编码小RNA在转录后调控机制中发挥作用。近些年研究表明，miRNA可在转录后水平调控NK细胞发育、成熟及功能，并在不同疾病中发挥不同的调控作用。本文对目前miRNA在NK细胞发育过程及功能调控中的作用进行综述。

杀伤细胞，天然；微小RNA；基因

自然杀伤（natural killer, NK）细胞作为固有免疫的重要细胞之一，在机体抵抗外来病原体及抗肿瘤机制中占重要地位。NK细胞的发育最早在胚胎肝脏进行，出生后发育转移到骨髓，后在外周淋巴器官分化成熟。成熟的NK细胞在激活状态下可以通过分泌IFN-γ、释放颗粒酶、穿孔素等杀伤靶细胞，或者通过细胞表面的FASL、TNF相关的凋亡诱导配体等分子促使靶细胞的凋亡[1]。目前对于NK细胞发育、成熟及功能调节的研究大多集中在转录水平[2]，但随着研究的深入，发现转录后水平在调节NK细胞应答方面同样发挥着重要作用。

微小RNA（microRNA, miRNA） 是转录后水平的细胞调控因子，是一种含有22个核（苷）酸序列的非编码小RNA。成熟的miRNA可以和与之互补的信使RNA（messenger RNA, mRNA）结合，抑制该mRNA转录或直接使其降解[3-4]。研究显示，miRNA发育不成熟会引起NK细胞的生存和功能的下降[5]，由此可见，miRNA在NK细胞发育、成熟以及功能的调节中起重要作用。本文对目前研究较明确的与NK细胞发育、成熟及功能相关的miRNA进行综述。

1 miRNA对NK细胞发育成熟的影响

NK细胞的发育及成熟受多种因素的影响，如环境、细胞间相互作用及细胞因子，现有研究证实，miRNA同样可以调控NK细胞的发育与成熟。目前有如下miRNA调控NK细胞发育成熟的机制较为明确。

1.1 miR-181 miR-181调控NK细胞从CD34+造血祖细胞向成熟细胞的分化发育。研究证实nemo样激酶（nemo-like kinase, NLK）的mRNA是miR-181靶基因，NLK可以通过抑制Notch信号途径阻碍NK细胞的发育，而miR-181可以抑制NLK水平，从而正向调控NK细胞发育[6]。

1.2 miR-150 动物实验证实，miR-150通过抑制靶分子转录因子c-Myb，促进NK细胞发育。miR-150基因缺失的小鼠NK细胞出现发育障碍，不能成为成熟的NK细胞；相反，miR-150过表达的转基因小鼠则可促进NK细胞的发育，表现出更加成熟的表型[7]。

1.3 miR-15/16 miR-15/16家族在NK细胞中表达较高，并且在细胞分化发育中发挥重要作用。miR-15/16基因敲除小鼠中，出现大量不成熟NK细胞，同时在不成熟细胞中c-Myb表达增多。若将miR-15/16基因敲除小鼠的c-Myb基因同时敲除，则可促进NK细胞的成熟。可见，miR-15/16通过抑制c-Myb来促进NK细胞的成熟[8]。

1.4 miR-583 与未成熟NK细胞相比，miR-583是成熟NK细胞中表达差异最大的miRNA之一，miR-583过表达可以抑制NK细胞的分化。若将IL-2Rγ 3´-UTR点突变，则miR-583的抑制功能消失。可见miR-583通过作用于IL-2Rγ 3´-UTR作为负调控因子抑制NK细胞的分化[9]。

2 miRNA对NK细胞分泌IFN-γ功能的影响

NK细胞是分泌IFN-γ的主要细胞之一。IFN-γ的分泌涉及多条细胞内信号途径[10]。如前所述，NK细胞表面的抑制性受体激活，可抑制NK细胞的活化，同时IFN-γ的分泌也会受到抑制。抑制性受体胞内免疫抑制基序通过Src同源区2蛋白、SHP-1、SHP-2抑制细胞内钙流信号同时抑制细胞内一系列因子的磷酸化水平，使IFN-γ的分泌受到抑制。而若NK细胞表面激活性受体与配体结合，通过细胞内免疫受体酪氨酸活化基序活化下游蛋白酪氨酸激酶（protein tyrosine kinases, PTKs），通过信号级联放大作用，最终可引起IFN-γ的分泌。此外IL-12、IL-18等都可刺激NK细胞分泌IFN-γ。下面具体阐述参与IFN-γ调控的重要miRNA。

2.1 miR-362-5p miR-362-5p是一种新发现的、正向调控NK细胞功能的miRNA。它高表达于外周血NK细胞，其靶基因为肿瘤抑制因子CYLD。CYLD是一种去泛素化酶，可抑制NK-κB信号通路，当miR-362-5p过表达时，可使NK细胞分泌IFN-γ、穿孔素和颗粒酶的能力增强[11]。

2.2 miR-155 miR-155对NK分泌IFN-γ起到正调控作用，在T细胞、B细胞、树突状细胞（dentritic cell, DC）以及巨噬细胞中发挥重要功能。在NK细胞中，miR-155于静息期适量表达，而在IL-12与IL-18共刺激活化后明显上升，表达量于刺激后24 h达到峰值。它不与IFN-γ的mRNA 3´端UTR直接作用，而是通过抑制SHIP-1途径，提高IFN-γ分泌量[12-13]。

2.3 miR-181a/b 如前所述，miR-181可以通过Notch途径促进NK细胞发育。研究人员还发现，miR-181a/b间接参与了IFN-γ的调控，当细胞过表达miR-181a/b时，IFN-γ的表达量出现上升。具体机制尚未阐明[6]。

2.4 miR-29 处于静息期的NK细胞适量表达miR-29，其调控IFN-γ的机制存在争议。Ma等[14]证实，miR-29可以直接调控NK细胞与T细胞中IFN-γ的表达，他们通过小鼠体内实验发现miR-29直接作用于IFN-γ的mRNA，从而抑制IFN-γ蛋白产物产生，而在应用拮抗物与miR-29竞争结合mRNA后，血清中IFN-γ的含量明显增高。Steiner等[15]证实miR-29可直接调控CD4+T细胞中T-bet和Eomes两个与IFN-γ mRNA相关的转录因子，间接抑制IFN-γ产物，但是不能直接调控IFN-γ mRNA。

2.5 miR-15/16 miR-15/16家族包括miR-15a、miR-15b和 miR-16，在小鼠细胞中直接作用于IFN-γ3´端UTR，miRNA的成熟需要Dicer酶的参与，在Dicer酶缺陷小鼠体内IFN-γ的分泌量明显上升，而miR-15/16表达下降被证明与IFN-γ的分泌直接相关，通过对IFN-γ 3´UTR点突变，miR-15/16对IFN-γ抑制作用消失[8]。

3 miRNA调控颗粒酶和穿孔素的分泌

NK细胞识别靶细胞后，通过分泌颗粒酶和穿孔素对靶细胞进行杀伤。小鼠NK细胞在静息期已经出现颗粒酶和穿孔素mRNA的转录，但激活的NK细胞相比于静息期其mRNA转录却只出现轻微上调。然而，激活后的NK细胞表达颗粒酶和穿孔素的量，及其细胞毒性作用却明显增强[16]。因此，推测转录后水平的调控在颗粒酶和穿孔素的表达量及其功能方面发挥了重要作用，miRNA作为转录后水平调控的重要分子之一，对颗粒酶、穿孔素的调节得到证实。

3.1 miR-150 利用miR-150基因敲除小鼠体内NK细胞和人初始NK细胞证实，miR-150与Prf1 mRNA 3´ UTR相结合，在转录后水平直接负向调控Prf1的表达。静息期NK细胞内miR-150表达较激活的NK细胞表达高，导致静息期Prf1分泌受到抑制。野生型小鼠NK细胞在IL-15刺激激活后miR-150表达下调，引起Prf1表达的升高，NK细胞杀伤功能增强，若将缺乏miR-150的NK细胞回输入免疫缺陷小鼠体内，能明显抑制小鼠体内肿瘤的生长[17]。

3.2 miR-378与miR-30e miR-378与miR-30e参与GzmB与Prf1的负调控，NK-92细胞核内转染miRNA抑制剂抑制miR-378或miR-30e，都可引起细胞毒性增强、杀伤肿瘤能力增强[18]。

3.3 miR-223 NK细胞被IL-15激活后，miR-223为下调最显著者，它参与了GzmB的负向调节且可以直接作用于小鼠GzmB 3´ UTR，然而在miR-233基因敲除小鼠NK细胞中，颗粒酶的分泌量、NK细胞毒性作用却与正常野生型小鼠无异，提示miR-233不是单独发挥作用，可能还存在其他因子或miRNA参与了此过程[19-20]。

3.4 miR-27a-5p 可直接作用于GzmB 和Prf1的mRNA 3´端UTR，当其过表达时，GzmB和Prf1蛋白表达量下降，但NK细胞被IL-15激活后miR-27a-5p表达上调，推测可能与防止NK细胞过度激活有关[21]。

3.5 miR-23a 全反式维甲酸（all-trans retinoic acid, ATRA）可抑制人体内NK细胞的杀伤功能。据研究证实，NK细胞激活后miR-23a下调，而miR-23a是下游靶基因组织蛋白酶C（cathepsin C, CTSC）的负调控因子，CTSC在细胞被激活后上调同时促进颗粒酶的分泌，而ATRA则可以诱导miR-23a上调，从而抑制CTSC表达，导致了NK细胞杀伤功能受损[22]。

4 不同疾病患者体内miRNA对NK细胞功能的调控

相较于健康人，很多疾病都会引起NK细胞功能的下降，如肝炎、肿瘤等[23]，从而导致患者免疫力下降，引起疾病的进展、恶化。近些年研究表明，疾病过程中NK细胞功能的下降与miRNA水平改变相关。

4.1 HCV感染 在HCV感染者的NK细胞中发现miR-155表达明显下降，同时NK细胞分泌IFN-γ功能下降。进一步研究发现miR-155可通过抑制Tim-3/T-bet从而上调NK细胞IFN-γ的分泌，因而在患者体内miR-155表达明显下降，Tim-3/T-bet增加，导致IFN-γ分泌明显减少[24]。同样在HCV感染中，miR-182调节NK细胞的功能机制尚无定论。一方面，HCV感染者NK细胞的miR-182相较于正常人上调，同时引起作为miR-182靶基因的NKG2D表达下降，抑制了NK细胞表面杀伤性受体的表达；但另一方面，体外miR-182过表达的HCV感染者NK细胞与HCV转染的Huh7共培养，发现NK细胞可以抑制病毒的复制，提示NK细胞功能的增强。所以HCV感染中miR-182影响NK细胞功能的具体机制还须进一步研究[25]。

4.2 小鼠巨细胞病毒（mouse cytomegalovirus, MCMV）感染 与HCV感染相反，在MCMV感染模型中，小鼠感染MCMV后miR-155表达于第2 d显著上调，体外刺激实验证明，感染后NK细胞需要在促炎因子IL-12及IL-18的共刺激条件下，通过信号传导和转录激活因子（signal transducers and activations of transcription, STAT）4途径上调miR-155表达[26]。由此可以看出，相同miRNA在细胞内的调控机制不完全一致，同时不同病毒感染对NK细胞miRNA的影响存在差异，而其具体机制仍须进一步讨论。

4.3 HBV感染 相较于健康人，慢性乙型肝炎（chronic hepatitis B, CHB）感染者和肝细胞癌（hepatocellular carcinoma, HCC）患者NK细胞杀伤功能降低，而患者NK细胞中的miR-146a明显升高[27]。miR-146a可通过作用于STAT1，这一与NK杀伤功能相关的重要的细胞信号通路蛋白，调控NK细胞的杀伤功能，过表达miR-146a的NK细胞STAT1表达下降。而相反，抑制了miR-146a后，STAT1表达上升。这一结果证明了CHB、HCC患者miR-146a升高而引起的STAT1表达下降，进而影响NK细胞的细胞毒性作用。这项结果提示了CHB、HCC患者NK细胞功能失调的新机制，同时能否通过抑制NK细胞miR-146a的表达治疗CHB和HCC也为临床药物的研发提供了新思路。

4.4 肿瘤 在肿瘤微环境中TGF-β的表达十分丰富，并且因此引起了广泛的免疫抑制作用，其中包括NK细胞功能的受损。Donatelli等[28]证实miR-183在TGF-β抑制NK细胞肿瘤杀伤功能中发挥了一定的作用。TGF-β可以降低DAP-12表达，DAP-12是NK细胞表面重要的激活性受体的组成部分，DAP-12的缺失影响下游激活性信号的传导。而TGF-β可诱导miR-183的上调，miR-183直接作用于DAP-12 3´ UTR抑制DAP-12的翻译，从而使NK细胞抗肿瘤杀伤功能受损。有临床证据表明，血清中miR-183可以作为生物标志物预测肾细胞癌对NK细胞杀伤的敏感性，即血清中miR-183浓度越高，NK细胞对癌细胞的杀伤敏感性越差[29]。此外miR-183也为肿瘤的治疗提供新的靶标，或许可以通过药物阻断NK细胞中miR-183的表达，增强其对肿瘤细胞的杀伤功能。

NK细胞中miR-30c-1(*)可以直接作用于抑制性转录因子HMBOX1，上调膜TNF-α的表达。miR-30c-1(*)过表达的NK细胞与体外肝癌细胞系SMMC-7721和HepG2共培养可以发现，NK细胞跨膜TNF-α表达上调，同时细胞抗肿瘤杀伤功能增强[30]。

5 小结与展望

随着对miRNA研究的深入，越来越多的证据表明，miRNA对NK细胞的发育、成熟和功能发挥的调控具有重要意义[31]。同时，在患者体内受病毒感染和肿瘤微环境等的影响，miRNA的表达出现变化，因此影响了NK细胞在抗病毒和抗肿瘤作用中的发挥，但这也为临床药物研究提供了新的靶点，为疾病的诊断和治疗提供了新的思路。

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（2017-01-02收稿 2017-02-10修回）

（本文编辑 胡 玫）

Research progress of roles of microRNA in development and function of natural killer cells

LIU Bei-bei, ZHAO Min*
Treatment and Research Center for Infectious Diseases, 302 Military Hospital of China Peking University Teaching Hospital,100039, China
*Corresponding author, E-mail: drzhaomin@sina.com

Natural killer (NK) cells, an important component of innate immune system, play a significant role in anti-viruses and anti-tumor cells in human body. The development and activation of NK cells are regulated by many cytokines and surface receptors. At present, the research on the development, maturation and function of NK cells has progressed from the level of transcription to the post transcriptional level. Being a non-coded mini RNA, microRNA (miRNA) plays a role in the post transcription regulatory mechanism. Recent studies have indicated that miRNA can regulate the development, maturation and function of NK cells in the post transcriptional level, and play different roles in different diseases. Here, this article summarizes the mechanism of regulation of miRNA related to the development and function of NK cells.

killer cells, natural; microRNA; genes

R-332；R373.21

A

1007-8134(2017)01-0061-04

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.01.018

国家自然科学基金面上项目（81470097）

100039，北京大学解放军第三〇二医院教学医院感染性疾病研究诊疗与研究中心（刘贝贝、赵敏）

赵敏，E-mail: drzhaomin@sina.com