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肺炎支原体感染实验室诊断的研究进展

2017-03-24王良玉辛德莉

传染病信息 2017年1期
关键词:滴度灵敏度特异性

王良玉,辛德莉

·综 述·

肺炎支原体感染实验室诊断的研究进展

王良玉,辛德莉

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, MP)是儿童社区获得性肺炎的重要病原之一。多数MP感染引起的临床症状较轻,具有自限性,但也有导致重症肺炎或肺外并发症的可能。近几年MP耐药率逐年上升,早期、快速诊断MP感染对疾病的治疗和预后相当重要。目前诊断MP感染的方法主要有分离培养、血清学诊断和分子生物学诊断。本文对近几年国内外实验室诊断MP感染技术的研究进展及各种诊断方法的优缺点作一综述。

肺炎支原体;感染;诊断

肺炎支原体(Mycoplasma pnenoumia, MP)属于柔膜体纲,支原体属,缺乏细胞壁,是目前发现的体积最小,基因片段最短的细胞生物,可自主完成复制。MP具有牢固吸附宿主细胞的尖端结构,主要粘附于上呼吸道的肺上皮细胞,依靠宿主细胞提供生存所需营养物质。宿主-病原体在呼吸道表面的相互作用决定其是否被宿主清除,剩余菌量决定是否引起临床感染症状。MP感染只在人体引起发病,经飞沫传播,可在呼吸道存活几个星期到几个月,潜伏期1~3周[1]。MP感染发病具有季节性,秋季多发,多数MP感染引起的临床症状较轻,具有自限性。MP与人体的心肌、肺以及脑组织存在共同抗原,感染后机体产生的抗体可与人的心肌、肝、肺以及脑组织产生交叉抗原抗体反应,形成抗原抗体复合物,引起肺外组织的病变,如肺炎、关节炎、溶血性贫血、肝坏死以及神经组织的损害等。MP感染可以发生在所有年龄段,通常老年人发病率最低,成年人次之,学龄儿童和青少年发病率最高。MP感染是儿童社区获得性肺炎(community-acquired pneumonia, CAP)的重要病原之一,约占儿童CAP的10%~30%[2-3]。MP感染多发生在家庭、学校、机关、野营区和军事基地等人口密集地方,每3~7年暴发流行1次,时间可达1年。Gotoh等[2]的研究表明各年龄段儿童MP的无症状携带率均较高,Meyer等[1]报道肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pnenoumiae pnenoumia, MPP)患者中肺外损伤的发生率高达25%。目前耐药性MP是引起儿童MP感染的主要病原菌,而耐药性MPP已经在世界范围内蔓延。在中国、日本和韩国等东亚国家普遍高度流行,在北美和欧洲相对中低度流行。早期、快速、准确诊断MP和耐药性MP对指导临床用药、疾病转归及预后起到至关重要的作用。

目前诊断MP感染的方法分为3类:MP分离培养及鉴定、血清学诊断方法和分子生物学诊断方法。

1 MP分离培养及鉴定

1.1 分离培养及鉴定 MP分离培养是诊断MP感染的金标准[4],通常从肺炎患者咽喉、鼻咽部、胸水或体液中培养分离。MP能在无生命的含胆固醇的人工培养基上生长,37 ℃能存活数小时,以二分裂形式繁殖,速度缓慢,培养周期较长(需10~14 d甚至更长时间)。将标本接种于胸膜炎微生物培养基,混匀后置于37 ℃,5% CO2培养箱中培养,同时设置阴性与阳性对照(MP标准株M129)。MP生长将培养基中葡萄糖发酵产酸,培养基pH值下降,酚红指示剂变黄可作为有MP生长的指征。

1.2 方法学评价 MP分离培养需要特殊培养基和实验室条件,受样本来源、保存、运输方式、样本中MP含量以及实验员技术水平等多种因素的影响,诊断MP感染的灵敏度仅为60%[5],对临床早期诊断的意义不大,常用于回顾性诊断和研究。

2 血清学诊断

在我国,常采用血清学方法诊断MP感染,通过检测血清中MP特异性抗体滴度的变化诊断是否为MP感染。试验方法包括特异性试验:补体结合试验(complement fi xation test, CFT)、明胶颗粒凝集(particle agglutination, PA)试验、ELISA、非特异性试验以及冷凝集(cold agglutination, CA)试验。现阶段以血清学检测确诊MP感染尚无统一标准,目前国际上多认为:急性期及恢复期的双份血清标本中,MP特异性抗体滴度呈4倍或4倍以上增高或减低时,可确诊为MP感染[6]。但是双份血清检查可行性差,没有早期诊断价值,单份血清特异性IgM抗体的明显升高是目前临床诊断MP感染的主要实验室依据。近年来临床上较多采用PA法测定IgM抗体,一般认为MPIgM≥1∶160有较高的诊断价值。

2.1 血清学诊断方法 CFT曾是检测MP感染的标准方法,主要检测早期IgM应答,对IgG不敏感。整体敏感性较差,无法区分抗体类型,特异性不高[7]。试验用的脂质抗原存在于人体组织及某些细菌,易出现交叉反应,造成假阳性结果,临床上很少使用。据报道CFT检测血清IgM抗体滴度,灵敏度仅为58.8%[8]。

PA试验灵敏度和特异性均明显优于CFT,在一些国家广泛应用于临床,阳性对诊断有意义,但同CFT一样无法区分抗体类型。PA滴度越高时IgM阳性可能性越大,但PA滴度与IgG是否阳性无明显关系。PA试验以抗体滴度1∶80或1∶160为诊断标准时,与PCR结果有较好的一致性,有研究者认为用PA试验检测双份血清可以作为确诊MP感染的依据[5]。

ELISA是国内目前诊断MP感染血清学试验中常用的方法,可分开检测IgM、IgG,灵敏度和特异性均能达到较高的水平。市售商品试剂盒很多,但缺乏大规模规范化的临床试验评估,较少有经过美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration, FDA)认证。Beersma等[9]以实时定量PCR为金标准,比较12种商品试剂盒的灵敏度和特异性,其中灵敏度和特异性最高的分别为77%和92%,最差的灵敏度仅为35%。商品化试剂盒检测MP感染的灵敏度受包括患者的年龄、实验室硬件条件、实验人员技术、标本采集时间、是否采集急性期以及恢复期双份血清等多种因素影响。商品试剂盒的质量良莠不齐,诊断标准不统一,进行大规模临床试验再次评估其质量,制定统一诊断标准,选择更为合适的检测试剂,对MP感染的诊断和治疗很有必要。

CA试验曾是诊断MP感染的常用方法,检测阳性率为约50%,腺病毒、巨细胞病毒及EB病毒等感染也可诱导血清冷凝集素的产生,属于非特异性诊断,目前此试验仅作为MP感染的参考。

2.2 方法学评价 血清特异性抗体IgM一般出现于MP感染后7~14 d,3~4周达高峰,可持续数月不等[8]。IgM抗体免疫应答所需时间较短,可作为早期诊断的指标,急性期患者血清中检出IgM多认为是新近感染。由于机体从感染MP到免疫应答产生抗体需要一定时间,采血时间对检验结果影响极大,血清标本采集过早,可能检测不到IgM变化,产生假阴性结果。检测IgM抗体滴度诊断MP感染,仅检测急性期血清抗体滴度阳性率为14%~45%,同时检测急性期、恢复期双份血清阳性率可提高至39%~88%;检测IgG抗体滴度诊断MP感染,仅检测急性期血清抗体滴度阳性率为39%~45%,同时检测双份血清阳性率可提高至73%~82%[10]。

MP感染儿童血清中IgM水平较健康儿童有明显升高,在初中时期达高峰,之后随年龄增长下降,至成人时期可能只产生IgG[11]。这可能使得IgM抗体水平诊断儿童MP感染更有意义,提示对诊断成人感染灵敏度稍差。Beersma等[9]采用FDA批准的用于诊断儿童MP感染的ImmunoCard试剂盒,仅检测IgM抗体水平,灵敏度也很高,单独检测IgM抗体水平也可用于诊断儿童MP感染。Talkington等[10]报道约20%的成人感染MP后并未检测到IgM抗体滴度的升高,单独检测IgM在诊断成人MP感染方面的意义相较于儿童较弱。

特异性IgG较IgM出现晚,通常在感染4~6周达高峰,上升速度较慢且在体内的持续时间较长(最长可达4年左右),由于IgM抗体产生的免疫学特点,对成人检测IgM可能造成错误诊断。目前我国临床上多采取同时检测IgG和IgM 2种抗体水平变化确诊MP感染。

特异性IgA的产生时间与IgM类似,在成人尤其是老年人中的反应水平更高。IgA抗体水平升高可能是急性期MP感染的重要提示,相较于IgM反应更快,可作为某些不能产生IgM的成人MP的感染的补充参考指标。老年人感染MP时,IgA抗体滴度升高可能更有利于诊断[11]。慢性阻塞性肺疾病急性加重期伴发MP感染时,血清学检验采用IgA抗体滴度变化往往也更可靠[12]。

由于血清抗体产生的免疫学特点,血清学试验诊断MP感染有一定的局限性。单份血清诊断MP感染灵敏度较差,即使是新近的快速血清学诊断酶标免疫分析(enzyme immumoassay, EIA)技术,其灵敏度也远远低于分子生物学诊断方法[5]。临床确诊MP感染往往须同时检测双份血清,双份血清采集时间须间隔2周左右,可用于流行病学调查,不适合作为一种早期快速诊断方法。另据台湾文献报道,临床上双份血清收集率不足10%[13]。综上所述,血清学诊断不宜单独作为MP感染早期快速诊断的方法。

3 分子生物学诊断

分子生物学诊断技术具有早期、快速、敏感和特异的优点。常用的实验方法有传统PCR、巢式PCR、实时定量PCR、依赖核酸序列的扩增技术(nucleic acid sequence-based amplif i cation, NASBA)、环介导的等温扩增(loop-mediated isothermal amplif i cation, LAMP)技术、RNA 恒温扩增实时荧光检测技术(simultaneous amplif i cation and testing, SAT)等。以这些实验方法的基本原理为基础,国内外学者又开发出可同时检测多种病原菌的复合技术。实验中常扩增的目的基因有P1蛋白编码基因,16S rRNA、card基因、ATP酶基因等。可供选择的临床标本类型有咽拭子、喉拭子、痰标本、肺泡灌洗液、血清、全血以及脑脊液等。国内外学者根据不同的实验室条件,实验目的和研究方向,尝试了多种诊断MP感染的方法。

3.1 分子生物学诊断方法

3.1.1 巢式PCR 相较于传统PCR,巢式PCR反应体系中含有两条引物,即使第一次扩增产生了错误片断,第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率也极低,因此特异性较高。Ursi等[14]的研究中,3个不同实验室采用巢式PCR检测MP感染敏感度为87.2%~97.4%,特异性为89.2%~97.4%。灵敏度、特异性均较高,可以为早期快速诊断MP提供参考。

3.1.2 实时定量PCR 实时定量PCR是一种新定量试验技术,它是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时监控反应过程,结合相应的软件对产物进行分析,计算待测样品模板的初始浓度[15]。相较于传统PCR有更高的灵敏度,能做定量分析,可用于早期诊断,并为疾病治疗的转归情况提供数据资料。以双份血清IgG抗体滴度变化作为金标准时,实时定量PCR的敏感性为81.8%,特异性为98.6%。当结合急性期血清学IgM抗体滴度变化时,实时定量PCR敏感性上升为91.7%。我们认为可以作为诊断MP感染的诊断手段[16],另有研究认为标本采集时间,或对实时定量PCR结果产生影响。随着病情的发展,实时定量PCR检测MP的灵敏度下降[17]。

3.1.3 LAMP技术 LAMP技术是近几年研发的新技术,有较高的敏感性和特异性,对仪器设备要求简单,恒温的实验条件易控制,能满足基层和现场调查的需要。LAMP商品试剂盒已经在日本投入使用,咽拭子是经FDA批准认证的可用标本。在Ratliff 等[18]的研究中,采用LAMP方法检测肺泡灌洗液和痰,诊断MP感染,也能取得较满意的结果。与血清学诊断方法比较,EIA检测IgM抗体滴度诊断MP感染,灵敏度和特异性分别为38.7%和76.9%;PA法诊断MP感染,灵敏度和特异性分别为19.4%和93.1%;LAMP诊断MP感染,其灵敏度和特异性分别为96.8%和100%,LAMP显著优于血清学诊断方法[19-20]。以培养为金标准,LAMP检测MP感染灵敏度和特异性分别为99.0%和100%[18]。若经过大规模规范化临床试验,评估其临床价值,制定合理收费标准,有望成为诊断MP的新方法。

3.1.4 NASBA NASBA是一种扩增RNA的技术,是由一对引物介导、连续均一的体外特异核苷酸序列等温扩增的酶促反应过程。此方法优势在于扩增的是RNA,RNA较DNA稳定性差,较易崩解,扩增RNA能较好的反应病原菌的生存性。NASBA和实时定量PCR诊断MP感染结果有较好的一致性[21]。

3.1.5 SAT技术 SAT是以RNA为模板检测MP的新技术,可实时反映MP在人体内的增殖状况、活跃程度,为疾病分期提供参考。

3.1.6 复合PCR 在同一反应中用多组引物同时扩增几种基因片段的方法就称为复合PCR。复合PCR方法可能会对筛检很有用[17],这种方法能同时检测几种支原体,或同时检测MP及其他导致肺部疾病的多种病原体。Khanna等[17]的研究中,复合PCR杂交方法可以同时检测5种包括MP在内的肺炎典型病原体,灵敏度和特异性分别是100%和98.5%。作者认为可以作筛查MP感染的方法。Loens等[22]报道复合PCR灵敏度低于单一PCR检测,但复合检测的灵敏度是否可以接受,须进行大规模的临床试验验证其对临床株的检出率。

3.2 目的基因的选取 Zhou等[3]研究中采用巢式PCR的方法比较了P1编码基因和16S rRNA对检测MP感染的意义,检测16S rRNA基因敏感度和阳性率(54.5%)均高于P1蛋白编码基因(45.5%)。Winchell 等[23]报道在美国亚特兰大的一次MP爆发流行中,分别以card基因,mp3基因、mp7基因为目的基因采用实时定量PCR的试验方法检测其敏感度,结果证实card基因较其他两种具有更高的敏感度

3.3 标本的选取 Räty等[24]研究采用16S rRNA为目的基因的PCR方法,分别以痰、咽拭子、喉拭子标本检测mp DNA,诊断MP感染,阳性率分别为69.0%、50.0%、37.5%。认为痰标本优于咽、喉拭子。Waites等[4]研究发现,血清学确诊的MP感染的年轻人,痰标本虽优于鼻咽拭子和喉咽拭子,但许多儿童和成人在MP感染后不产生痰,结合临床,喉咽拭子和鼻咽拭子在标本获取方面,相较于痰更有优势。Winchell等[23]研究认为鼻咽拭子和喉咽拭子的灵敏度和特异性相等,综合各方面研究结果认为,同时检测鼻咽拭子和喉咽拭子可以提高诊断率。

Xu等[25]研究采用巢式PCR的方法,检测咽拭子和肺泡灌洗液中DNA含量,以期确定更适于MP感染诊断的标本类型。咽拭子的灵敏度和特异性分别为78.6%和63.4%,肺泡灌洗液的灵敏度和特异性分别为70.3%和58.7%,综合考虑经济因素,临床意义和获取标本对患儿伤害程度等多方因素,认为咽拭子在诊断MP感染方面较肺泡灌洗液更为合适。

3.4 分子生物诊断方法评价 分子生物学方法,虽然能在MP感染急性期做出诊断,但据研究发现在健康人群中MP携带率达0.1%~13.5%[16],MP感染后DNA可在上呼吸道存在7周~7个月时间[26],即使分子生物学可检测到mp DNA,也不能确诊为MP感染还是MP携带者。须结合临床症状及其他诊断方法,做出诊断。Saraya等[27]研究采用PCR检测咽拭子和肺泡灌洗液诊断CAP中MP感染率,阳性率分别为48.5%和40.9%,高于多数研究中报道的10.0%~30.0%。这种现象可能就是因健康人的无症状携带或感染后mp DNA的持续存在造成的。单独依据PCR结果做出MP感染的诊断就可能出现假阳性结果,造成过度诊断。另外,目前各实验室多采用自己方法检测MP感染,缺乏统一标准,给实验室诊断方法的评估带来一定困难。Chang等[13]报道,相同的标本于3个不同的实验室采用相同的方法检测MP感染,尽管3个实验室在经验和实验条件方面相当,得出的结果仍不一致。出现这种现象可能是诊断标准不一致所造成的。开展多中心实验,评估实验方法,以期找到最合适的诊断方法和实验室条件,为MP感染的诊断提供统一标准是很有必要的。

采用呼吸系统样本进行PCR的基础方法,已经广泛用于MP感染的快速诊断。但在不同的个体用PCR方法诊断MP感染存在较多影响因素,包括:患者的年龄、症状出现的间隔、标本采集时间、样本的采集方法以及PCR靶基因和实验员技术水平等。因受患者年龄的影响,对于不超过3岁MP感染患者,由于患儿体内的免疫反应不成熟,采用分子生物学诊断方法可能较血清学诊断更为准确。另外,由于疾病不同时期,机体免疫状态不同,感染菌量不同,选择不同的诊断方法可能也会影响诊断的准确性。在疾病的早期阶段,由于机体免疫应答的产生需要一定时间,培养和核酸扩增为更可取的诊断方法。而在后期阶段,由于MP在气道中负荷量较低,可能血清学诊断相对更有意义。有学者推荐在病程早期阶段用培养和核酸扩增法,后期阶段用血清学检查法[28-29]。

4 小 结

无论是分离培养,血清学检测,还是分子生物学检测,都存在各自的局限性,目前学者多推荐采用2种或2种以上诊断方法相结合,以提高诊断的准确性[29]。针对不同的诊断方法,具体分析实验中出现的结果不一致现象,适当调整试验方法,综合考虑临床、经济性以及可操作性等问题,探索并制定出更适合于临床的快速、准确、经济的诊断方法,必将推动MP感染临床诊断和治疗的进一步发展。

总之,我们仍须不断探索更适合临床诊断的诊断方法,结合临床症状准确判断感染类型、疾病分期,从而制定合理的治疗方案,选择合适的药物,以期获得理想的治疗效果。

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( 2016-03-06收稿 2016-05-08修回)

(本文编辑 胡 玫)

Research progress on laboratory diagnostic techniques for Mycoplasma pneumoniae infection

WANG Liang-yu, XIN De-li*
Beijing Key Laboratory for Research on Prevention and Treatment of Tropical Disease; Beijing Tropical Medicine Research Institute; Beijing Friendship Hospital, Capital Medical University, 100050, China
*Corresponding author, E-mail: xindl48@126.com

Mycoplasma pneumoniae (MP) is a common cause of community-acquired pneumonia (CAP) in children. Although the clinical syndromes of most cases are mild and self-limited, MP infections can also result in refractory MP or extrapulmonary complications. And with the increase of MP drug-resistance rate, early and fast diagnosis of MP infection is quite important to the treatment and prognosis of this disease. At present, the main diagnostic methods to MP infection are isolated culture, serology diagnosis and molecular biological diagnosis. Research progress on diagnostic techniques for MP infection and the advantages and disadvantages of each diagnostic method in domestic and foreign laboratories in recent years are reviewed in this article.

Mycoplasma pneumoniae; infection; diagnosis

R375

A

1007-8134(2017)01-0051-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2017.01.016

北京市科技计划课题(Z131100004013029)

100050,首都医科大学附属北京友谊医院北京热带医学研究所 热带病防治研究北京市重点实验室(王良玉、辛德莉)

辛德莉,E-mail:xindl48@126.com

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