辽宁绒山羊精液冷冻稀释液的配方筛选

张 倩

(鞍山市千山区动物疫病控制中心,辽宁鞍山 114001)

辽宁绒山羊精液冷冻稀释液的配方筛选

张 倩

(鞍山市千山区动物疫病控制中心,辽宁鞍山 114001)

为了使辽宁绒山羊精液在冷冻保存时具有更好的活性，本实验采用一步稀释法，通过检测精子活率、质膜完整性、线粒体活性、顶体完整率评价精液品质的方法比较六种冷冻稀释液。筛选出了适合辽宁绒山羊精液冷冻的最佳基础冷冻稀释液配方（100ml）：Tris 3.44g，柠檬酸1.83g，果糖1.26g，卵黄15%，甘油5%。

辽宁绒山羊 精液 冷冻稀释液 配方筛选

辽宁绒山羊主要分布在辽宁东部山区以及辽东半岛地区，具有体格大、抗逆性强、产绒量高、绒纤维细长、绒毛比例高、绒毛洁白、手感柔软等优良品质。羊精液的冷冻保存不仅能提高种公羊的利用率，而且能降低繁殖成本，对人工授精技术的推广应用，对养羊生产的发展都产生了巨大的推动作用。但是，山羊精液在冻前和冻后损伤较大，山羊精液冷冻保存技术的研究远较其他家畜冷冻精液的发展缓慢。关于辽宁绒山羊精液冷冻稀释液的研究未见报道，为了更好地开发和利用辽宁绒山羊这一独特的生物资源，本文将对辽宁绒山羊精液冷冻稀释液的配方进行研究。

1 试验方法

1.1 精液的采集

用假阴道法采精，采精后首先，用肉眼进行观察，公羊政策射精量平均1ml，颜色乳白色或乳黄色，无异味。其次用低倍显微镜（100倍）观察精子密度和活动。在显微镜视野中，可看到翻腾云雾状态，精子密度越大，活动越强，其云雾状越明显。最后，在高倍显微镜（300～600倍）下评定精准活动及密度。在载玻片上滴精液1滴，加载玻片，在显微镜下看精子活动方式有直线前进运动、回旋运动和摆动三种。直线运动越多，活力就越大。直线运动精子只有达到60%以上，才能供使用。

1.2 精液的稀释

采集合格的精液混匀后分别用六组基础稀释液（表1）稀释，精液先缓慢放进六个离心管内，在缓慢加入等温的稀释液，边加边混匀，精液与稀释液的比例为1：3。

表1 六种基础稀释液配方

1.3 平衡

精液稀释后用十层纱布或者卫生纸包裹好放进4℃冰箱，或者把稀释好的精液离心管放进水里然后放入4℃冰箱。精液平衡期间不能随便从平衡槽里取出来。

1.4 分装及冷冻

用1ml注射器（把200μl取样枪头从中间剪开，将尖头部插入注射器头部）将精液吸入0.25 ml的细管内，精液装细管时最好戴上手套，避免手的温度使其升温，管尾部留约1cm的空间，以备封口用，然后放入封口机进行封管标识，封管用细管输送封装机，封管后用液氮冷冻以备后用。

1.5 精液品质的测定方法

取出分装后的冷冻精子样品分别进行精子活率的测定，质膜完整率的检测，顶体完整率的检测，线粒体活性检测。

1.6 结果与分析

经过SPSS V13.0软件分析后，对数据进行显著性检验。实验结果表明，在所选用的6种冷冻稀释液中。E组稀释液冻后精子活率，顶体完整率，质膜完整率，线粒体活性均显著高于A、C、F组的稀释液（P＜0.05）。与B、D组稀释液相比效果不显著（P＞0.05），但各项指标都相对高于B、D组稀释液。因此筛选出E组冷冻稀释液，作为辽宁绒山羊精液冷冻稀释液的配方。

2 讨论

本实验通过比较6种冷冻稀释液对精液冷冻解冻后活率、顶体完整率、质膜完整率与线粒体活性的效果，初步筛选出山羊细管冷冻基础稀释液E（100ml）：Tris 3.44g，柠檬酸1.83g，果糖1.26g，卵黄15%，甘油5%。Tris具有良好的缓冲性和渗透性，适宜于长期冷冻保存，Tris与柠檬酸将稀释液的酸碱度维持在一个相对稳定的范围内，可以起到维持精子生存环境相对稳定。果糖几乎是近几年在国内外动物精液冷冻稀释液中必不可少的添加物。果糖是牛和人的精液中存在的唯一的还原糖。果糖实际上比葡萄糖更容易被代谢，因为它可以绕过糖酵解途径的限速酶，6-磷酸果糖激酶-I。可以快速地给精子提供能量和营养。卵黄和精子融合后，能在精子表面形成保护膜，在冷冻过程中保持精子膜完整性。其中低密度脂蛋白（LDL）和磷脂是起到保护作用的有效成分。甘油能与细胞里的水分子结合，使溶液黏性增加，减少冷冻过程中冰晶的形成，在众多的冷冻保护剂中没有发现那一种的冷冻保护效果能优于甘油。