聚酰胺分离纯化黄栌叶漆黄素工艺研究

徐 娜 许凯扬 - 方 芳 舒孝顺 - 李赤翎 -

(长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410114)

黄栌(Cotinuscoggygriascop.)为漆树科黄栌属植物，一直被用作保持水土的防护林和园林绿化的景观植物。近代研究表明其具有抑制前列腺素生成、解痉、抗肿瘤及治疗黄疸型病毒肝炎等作用[1-3]，其中，漆黄素为主要有效成分[4]，含量由叶、茎枝、根依次递减[5]。此外，由于漆黄素化学结构式中B环上存在邻苯二酚羟基，故也常用作抗氧化剂[6]，可用于功能性食品、药品的开发。目前对于漆黄素的研究主要集中在提取、应用等方面[7-8]，而有关漆黄素分离纯化的研究，报道较少[9]。

柱色谱技术是植物功能成分分离的常用方法，发展迅速，已经应用到生物医药工程等各个领域。张伟[10]、王克勤[11]、苗建武[12]等分别对聚酰胺树脂分离山楂提取物中的总黄酮、芹菜黄酮、丹参总酚酸的工艺进行了研究。由于漆黄素富含羟基，可通过分子中的酚羟基与聚酰胺分子中的酰胺基形成氢键蒂合产生吸附[11]，故本试验拟以黄栌叶粗提物为原料，研究聚酰胺分离纯化黄栌叶漆黄素的工艺条件，旨在为漆黄素的开发和利用提供有益的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

黄栌叶：购于河南南阳，烘干粉碎后置阴凉干燥处备用；

漆黄素标准品：西安汇林生物科技有限公司；

聚酰胺：80～100目，武汉立思捷科技有限公司；

氢氧化钠、盐酸、无水乙醇：分析纯。

1.1.2 主要仪器设备

电热鼓风干燥箱：101A-2型，天津市泰斯特仪器有限公司；

中草药粉碎机：FW177型，天津市泰斯特仪器有限公司；

精密电子天平：FA2014型，天津天马衡基仪器有限公司；

超声波清洗机：SB3200D型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

旋转蒸发器：RE-52型，巩义市予华仪器有限责任公司；

紫外可见分光光度计：UV-5200型，上海元析仪器有限公司；

层析柱：φ2 cm×30 cm，武汉立思捷科技有限公司；

恒温振荡器：THZ-C型，苏州培英实验设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 聚酰胺树脂的预处理与回收 市售的聚酰胺用乙醇浸泡2 h，用3～4倍体积的乙醇洗至溶液透明后蒸至无残留物。再依次用2倍体积5%的NaOH溶液、1倍体积蒸馏水、2～3倍体积10%的醋酸溶液洗涤，最后用蒸馏水洗至中性，滤取树脂，自然晾干，备用。使用过的聚酰胺一般用5%的NaOH溶液洗涤，洗至NaOH溶液颜色很淡，然后水洗，再用10%的醋酸液洗，最后用蒸馏水洗至中性即可[13]。

1.2.2 粗提物的制备 称取粉碎后黄栌叶500 g，用60%的丙酮溶液(5 000 mL)超声提取30 min，过滤，重复2次，合并滤液，浓缩至无丙酮味，冷冻干燥，测得漆黄素含量后备用。

1.2.3 漆黄素的测定 采用紫外分光光度法[14]。

(1) 标准曲线的绘制：精密称取漆黄素标准品2.00 mg，用60%丙酮溶解，定容至100 mL容量瓶中。精确吸取0.00，1.00，2.00，3.00，4.00，5.00，6.00 mL于10 mL容量瓶中，用60%丙酮定容至刻度，在最大吸收峰366 nm处测定其吸光度，所得数据经回归处理，得到标准曲线回归方程为A=0.075 9C-0.027 3，相关系数为R2=0.999 7。

(2) 样品漆黄素的测定：取一定量样品，按漆黄素标准曲线测定方法测定样品吸光度，带入回归方程得出浓度。

1.2.4 静态吸附试验

(1) 上样量的确定：分别称取聚酰胺0.5，1.0，2.0，3.0，4.0 g，加适量的水充分膨胀后(以下均做此处理)，再分别加入漆黄素浓度为0.267 9 mg/mL提取液20 mL，振荡24 h后，吸取上清液测定漆黄素浓度，按式(1)和(2)计算吸附量和吸附率。

(1)

(2)

式中：

X1——吸附量，mg/g；

X2——吸附率，%；

C0——初始浓度，mg/mL；

C1——吸附后浓度，mg/mL；

V——吸附液体积，mL；

W——树脂质量，g。

(2) 吸附时间的确定：准确称取6 g聚酰胺树脂，加入漆黄素浓度为0.267 9 mg/mL的提取液40 mL，振荡，分别在0.25，0.50，1.00，2.00，3.00，4.00 h取样，测定漆黄素浓度，计算吸附量。绘制静态吸附动力曲线图。

(3) 洗脱剂浓度的选择：分别称取9份3 g聚酰胺，加入漆黄素浓度为0.267 9 mg/mL的提取液20 mL，振荡1 h后，滤出树脂，烘干，再分别加入20%，30%，40%，50%，60%，70%，80%，90%，100%的乙醇溶液各100 mL，振荡2 h后，取上清液测定漆黄素浓度，按式(3)和(4)计算解析量和解析率。

(3)

(4)

式中：

J1——解析量，mg/g；

J2——解析率，%；

C2——解析液浓度，mg/mL；

V——解析液体积，mL；

W——树脂质量，g。

1.2.5 动态吸附试验

(1) 上样流速的确定：取5 g聚酰胺装入层析柱中，将3份漆黄素浓度为0.267 9 mg/mL的提取液30 mL分别以0.5，1.0，2.0 mL/min的流速通过聚酰胺柱，进行动态吸附，收集流出液，测定漆黄素浓度，计算吸附率。

(2) 样品浓度的选择：取5份5 g聚酰胺装入层析柱中，分别加入漆黄素浓度为0.267 9，0.535 8，1.071 6，1.607 4，2.143 2 mg/mL的提取液30 mL，以1 mL/min的流速通过聚酰胺柱，收集流出液，测定漆黄素浓度，计算吸附率。

(3) 上样量的确定：取5 g聚酰胺于层析柱中，加入漆黄素浓度为0.535 8 mg/mL的提取液100 mL，以1 mL/min的流速通过聚酰胺柱，收集流出液，每10 mL为一管，测定漆黄素浓度，绘制泄露曲线。

(4) 洗脱剂浓度的确定：取5 g聚酰胺于层析柱中，加入漆黄素浓度为0.535 8 mg/mL的提取液40 mL，以1 mL/min 的流速通过聚酰胺柱。用水洗至无色后，分别用10%，30%，50%，70%，90%的乙醇进行梯度洗脱，收集洗脱液，测定漆黄素浓度。

(5) 洗脱液用量的确定：取5 g聚酰胺于层析柱中，加入漆黄素浓度为0.535 8 mg/mL的提取液40 mL，以1 mL/min 的流速通过聚酰胺柱。用水洗至无色后，用120 mL 体积分数为70%的乙醇进行洗脱，收集洗脱液，每10 mL为一管，测定漆黄素浓度，绘制洗脱曲线。

2 结果与讨论

2.1 静态吸附试验

2.1.1 上样量的确定 由表1可知，漆黄素量一定时，吸附率随树脂量的增多而增加。当漆黄素量与树脂量的比值为1∶372 (g/g)时，吸附基本达到饱和，此时再增加树脂量，吸附率变化较少，为节约成本，宜选择1∶372 (g/g)为最佳上样量。

2.1.2 吸附时间的确定 由图1可知，吸附量在前1 h内增长较快，1～2 h变化趋于平缓,2 h后基本达到吸附平衡。这是由于吸附初期，树脂表面与漆黄素接触充分，而吸附后期受到孔容的限制[15]。故选择1 h为静态吸附时间。

表1 不同上样量的静态吸附测定结果

图1 静态吸附动力学曲线图Figure 1 kinetics curve diagram of static adsorption

2.1.3 洗脱剂浓度的选择 由图2可知，解析率随乙醇浓度的增加而增大，当乙醇浓度为60%时，解析率最大，此后再增加乙醇浓度，解析率变化不大。考虑效益和成本，宜选择60%的乙醇为洗脱剂。

图2 洗脱剂浓度对解析率的影响Figure 2 Effect of eluent concentration on analytical rate

2.2 动态吸附试验

2.2.1 上样流速的确定 由图3可知，吸附率随上样流速的增加而减小，上样流速过大，样品未被吸附就流出树脂柱；流速过小，试验周期长。从吸附效果与试验周期考虑，选择1 mL/min 作为上样流速。

2.2.2 样品浓度的选择 由图4可知，当漆黄素浓度为0.535 8 mg/mL时，吸附率最大，若再加大样品浓度，吸附率反而呈下降趋势。这是由于过高的样品浓度不利于扩散和吸附。故选择0.535 8 mg/mL为上样浓度。

2.2.3 上样量的确定 由图5可知，从40 mL开始，漆黄素开始发生泄露，当上样量为70 mL时，流出液中漆黄素浓度达到0.404 7 mg/mL，接近进样浓度。故选择40 mL为最大上样量，约为2 BV。换算成漆黄素与树脂量的比值约为1∶233 (g/g)，与静态吸附上样量1∶372 (g/g)相比，动态吸附效率较高。

图3 上样流速对吸附率的影响Figure 3 Effect of sample velocity on adsorption rate

图4 样品浓度对吸附率的影响Figure 4 Effect of sample concentration on adsorption rate

图5 泄露曲线图Figure 5 Leakage curve

2.2.4 洗脱剂浓度的确定 由表2可知，10%，30%，50%，70%乙醇洗脱混合物漆黄素占全部洗脱所得漆黄素量的97%，已洗脱出漆黄素的绝大部分，残留的漆黄素量较少，从经济方面考虑，宜选择70%乙醇作为洗脱剂。

2.2.5 洗脱液用量的确定 由图6可知，漆黄素含量随洗脱液用量的增加而增加，第8收集管漆黄素浓度较低，此时，可以认为绝大部分漆黄素已被洗脱下来。故选择80 mL作为最适洗脱量，约为4 BV。

表2 不同浓度乙醇洗脱混合后漆黄素含量

图6 洗脱曲线图Figure 6 Elution curve diagram

2.3 精制次数对漆黄素纯度的影响

将黄栌叶粗提物配置成浓度为0.535 8 mg/mL的溶液，以2 BV为上样量，1 mL/min的流速通过80～100目的聚酰胺柱，吸附完成后，水洗至无色，然后用4 BV体积分数为70%的乙醇洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至无乙醇味，冷冻干燥，计算纯化物中漆黄素的质量分数，重复精制3次。

表3 精制次数对漆黄素纯度的影响

由表3可知，黄栌叶粗提物经过聚酰胺树脂的3次吸附和解吸后漆黄素含量由粗品的10.30%升高到了79.82%，纯度提高了6.75倍。

3 结论

树脂法具有工艺简单，成本低廉，无有害残留物等优点，广泛应用于有效成分的分离与纯化。而聚酰胺可通过分子中的酰胺羰基与黄酮类化合物中的酚羟基形成氢键蒂合而产生吸附作用，故聚酰胺是分离纯化黄酮类化合物较好的吸附剂。本试验考察了聚酰胺分离纯化黄栌叶漆黄素的工艺，确定了最佳条件：上样流速1 mL/min，样品浓度0.535 8 mg/mL，上样量2 BV，洗脱剂为70%的乙醇，洗脱剂用量4 BV，在此工

艺条件下，黄栌叶粗提物经聚酰胺树脂精制3次后漆黄素纯度提高了6.75倍，表明此分离纯化方法可行。但本试验仅对聚酰树脂分离纯化黄栌叶漆黄素的工艺条件进行了单因素试验，在此基础上对纯化条件进一步优化，可通过正交或响应面试验探究各影响因素之间关系，为下一步提纯工艺提供参考。

[1] 王继红. 从木腊树中提取非瑟酮的研究[J]. 实验室科学, 2012, 15(6): 87-89.

[2] 廖洪利, 吴也, 臧志和. 漆黄素抗肿瘤作用研究进展[J]. 天津药学, 2013, 25(6): 44-46.

[3] 李建华, 段丹丹, 马聪玲, 等. 黄栌有效成分漆黄素提取工艺研究[J]. 中华中医药杂志, 2012, 27(7): 1 956-1 958.

[4] 陶峰, 颜仁杰, 周海凤, 等. 黄栌化学成分与药理活性研究进展[J]. 世界临床药物, 2014, 35(2): 109-112.

[5] 王俊杰, 江善青, 王刚, 等. 黄栌植物化学成分、药理作用与临床应用研究进展[J]. 国际中医中药杂志, 2015, 37(3): 283-285.

[6] 陈兴玉, 李萍, 张昌华, 等. 漆黄素与酸、碱、盐反应的动态紫外吸收光谱[J]. 光散射学报, 2013, 25(4): 429-432.

[7] 陈虹霞, 王成章. 漆树黄酮类化合物研究进展[J]. 天然产物研究与开发, 2013, 25(12): 1 752-1 758.

[8] 刘东锋, 李法庆, 杨成东. 一种漆黄素的提取方法: 中国, 201010500143.0[P]. 2010-10-09.

[9] 龙丽辉, 郭增军. 黄栌中漆黄素提取工艺及含量测定方法的研究进展[J]. 中华临床医学研究杂志, 2006，12(21): 2 937-2 938.

[10] 张伟, 葛志强, 蒋建兰. 聚酰胺树脂分离纯化复方山楂提取物中总黄酮的研究[J]. 中草药, 2009, 40(1): 63-66.

[11] 王克勤, 严志慧, 罗军武, 等. 聚酰胺树脂分离纯化芹菜黄酮的工艺研究[J]. 食品与机械, 2009, 25(3): 46-50.

[12] 苗建武, 陈绍民, 王超, 等. 聚酰胺树脂分离纯化丹参总酚酸的研究[J]. 中国实验方剂学杂志, 2011, 17(3): 28-30.

[13] 周林. 桑枝黄酮提取分离及抗氧化活性研究[D]. 重庆: 西南大学, 2011: 30.

[14] 申庆亮, 李建华, 于盛茂, 等. 紫外分光光度法测定黄栌糖浆中漆黄素含量[J]. 中国中药杂志, 1990, 15(7): 40-41.

[15] 董江涛. 柿黄酮的提取、纯化及抗氧化性研究[D]. 上海: 上海海洋大学, 2010: 43.