柠檬果皮精油主要组分抑菌及抗氧化活性研究

章 斌 侯小桢 - 秦 轶 丁 心 邓其海 - 黄林洁 -

(1. 韩山师范学院食品工程与生物科技学院，广东 潮州 521041；2. 广东中兴绿丰发展有限公司，广东 河源 517000)

柠檬果皮精油(lemon peel essential oil，LEO)是从柠檬果皮中提取的一种挥发性油状液体物质，富含dl-柠檬烯、γ-萜品烯、α-松油醇、E-柠檬醛等成分，具有良好的抗氧化、抑菌、降血脂等功效；适用于食品、化妆品、香精香料等行业[1-3]。受产地、品种、生态地理条件、植物年龄和采收期、提取方法与提取部位、提取溶剂种类等因素影响，植物挥发性精油的化学成分与含量差异较大，因而其功能活性存在一定差异的同时也表现出一定的波动性；另一方面，构成精油的醇类、醛类、烯类等化学组分因其含量和理化特性的差异，对精油特定生理活性的贡献度也存有较大差异：如柠檬烯有较好的抗菌[4-5]、促伤口愈合[6]等功效，萜品烯可有效杀除伊氏锥虫[7]和氧化皮肤过敏原[8]，松油醇可通过诱导细胞凋亡而抑制肿瘤细胞生长[9]。

目前，国内外对包括柠檬精油在内的多种植物挥发性精油的抗氧化与抑菌作用已有较多报道[3]，不同植物精油复配后的抗氧化与抑菌作用也有一定报道[10-11]；但有关精油主要组分的抗氧化与抑菌研究较少，且现有的研究[10]均是侧重于单一组分开展；而有关栽培面积最广的尤力克(Eureka)品种柠檬的LEO主要组分的抗氧化与抑菌研究未见报道，且有关精油主要组分在抗氧化与抑菌方面的复配协同效应亦未见报道。因此，针对LEO良好的抗氧化与抑菌作用，在前期采用GC-MS法检测尤力克柠檬(产地河源)果皮精油的化学组成基础上[3]，着重探讨LEO中dl-柠檬烯、γ-萜品烯、α-松油醇3个主要成分及其复配物的抗氧化与抑菌作用，以期为更好地开发利用LEO提供一定参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

dl-柠檬烯、γ-萜品烯、α-松油醇：西陇化工股份有限公司；

卵磷脂、PBS、TCA、FeSO4、H2O2、丙酮、冰乙酸、二甲胺、柠檬酸、磷酸氢二钠、琼脂、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠等：分析纯，广东环凯微生物科技有限公司；

大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)：韩山师范学院微生物实验室提供；

LEO：前期测得其dl-柠檬烯、γ-萜品烯和α-松油醇含量分别为42.93%，8.41%，6.39%，广东中兴绿丰农业科技发展有限公司；

电热恒温水浴锅：HWS-12型，上海一恒科学仪器有限公司；

电子分析天平：JA2003型，上海舜宇恒平科学仪器有限公司；

无菌操作台：BOXUN型，广州嘉东实验室设备有限公司；

紫外可见分光光度计：UFJ-7200型，上海尤尼科仪器有限公司；

精密量具电子数显游标卡尺：SYNTEK型，0～150 mm，太欣半导体股份有限公司；

数显恒温生化培养箱：BS-4G型，常州市凯航仪器有限公司；

立式电热压力蒸汽灭菌锅：LD2X-30KA型，上海申安医疗器械厂；

电热恒温培养箱：DHP-9162型，上海捷呈实验仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 抗氧化活性试验

(1) DPPH自由基清除能力的测定：根据文献[3]所述方法进行测定，并按式(1)计算清除率。

(1)

式中：

R1——DPPH自由基清除率，%；

A——样液与DPPH液反应后的吸光度值；

A0——样液与95%乙醇反应后的吸光度值；

A1——95%乙醇与DPPH液反应后的吸光度值。

(2) 羟自由基清除能力测定：根据文献[3]所述方法进行测定，并按式(2)计算清除率。

(2)

式中：

R2——羟自由基清除率，%；

A——结晶紫溶液、FeSO4溶液与H2O2溶液反应后的吸光度值；

A0——结晶紫溶液与FeSO4溶液反应后的吸光度值；

A1——样液与结晶紫溶液、FeSO4溶、H2O2溶液反应后的吸光度值。

1.2.2 抑菌试验

(1) 抑菌圈大小的测定：制备浓度为106CFU/mL的菌悬液并取0.1 mL加入装有培养基的平皿中，待混匀凝固后，在培养基表面垂直放置3个牛津杯并分别加入纯LEO、α-松油醇、γ-萜品烯、dl-柠檬烯和3种单体成分的复配物各50 μL，于37 ℃恒温培养24 h后测量抑菌圈大小。抑菌圈试验判定标准[12]：极敏，直径>20 mm；高敏，15～20 mm；中敏，10～15 mm；低敏，7～9 mm；不敏感，直径<7 mm；“-”表示未测出抑菌圈。

(2) 最低抑菌浓度(MIC)的测定：用丙酮配制一定浓度的LEO、α-松油醇、γ-萜品烯、dl-柠檬烯和3种单体成分的复配物溶液，使其在混匀后的培养基中浓度分别为250.0，125.0，62.5，31.25，15.6，7.8，3.9，2.0，1.0 μL/mL，然后进行平板划线并于37 ℃恒温培养24 h，以能明显抑制供试菌生长的最低浓度为3种单体物质的MIC。

(3) 单体成分复配的抑菌试验：将浓度为1 μL/mL的dl-柠檬烯、γ-萜品烯和α-松油醇按一定体积比复配，再按1.2.2(1)和1.2.2(2)进行抑菌试验。

1.3 数据处理

试验结果以平均值±标准偏差SD表示，进行3次平行试验，并用Excel和SAS 8.1统计软件进行处理分析。

2 结果与分析

2.1 抗氧化活性

2.1.1 对羟自由基(OH·)的清除作用 萜烯类化合物含有2个或2个以上的双键，具有较强的反应活性，可与OH·结合加成为二级基团，从而具有一定的OH·清除作用。

由图1可知，试验浓度下的LEO对OH·清除率为98.08%～99.63%，清除效果良好且远强于其主要组分dl-柠檬烯、γ-萜品烯、α-松油醇的；陈思佳等[13]研究LEO、柠檬烯清除OH·的结果表明：LEO的OH·清除能力(IC50为0.013 mg/mL)强于柠檬烯(IC50为0.004 mg/mL)的，与本试验的研究结论一致。这说明精油中还有酚类、酮类、醛类等成分同样具有抗氧化活性[14]31-32[15]，如Mário等[16]的研究证实除单萜外，某些非挥发性化合物可能有助于增强柠檬烯及其生物转化提取物等挥发性成分的抗氧化活性，从而使精油的抗氧化性能高于单体物质。

同时，图1表明dl-柠檬烯、γ-萜品烯、α-松油醇对OH·的清除率较为接近，并均随浓度增大而快速上升，且单体物质的浓度超过4 mg/mL后，α-松油醇相比γ-萜品烯和dl-柠檬烯对OH·的清除效果更佳。由此，可初步推断三者对LEO清除OH·的作用有着大小接近的贡献度，且α-松油醇在高浓度下的贡献权重可能更大。

图1 dl-柠檬烯、γ-萜品烯、α-松油醇和 LEO清除·OH能力Figure 1 Ability of dl-limonene, γ-terpinene, α-terpineol and LEO to remove ·OH

2.1.2 对DPPH自由基的清除作用 植物挥发性精油中的酚类、烯类、醇类化合物[17]可阻断氧化反应的自由基链，一定程度上可清除DPPH自由基：如γ-萜品烯含有的非共轭二烯可直接清除DPPH自由基[18]。由图2可知，α-松油醇、γ-萜品烯、dl-柠檬烯对DPPH自由基的清除作用均随浓度增大而有较平缓的增强，且三者的清除作用强弱顺序表现为dl-柠檬烯>α-松油醇>γ-萜品烯，γ-萜品烯在2 mg/mL浓度下的清除率最低为31.68%；LEO则对DPPH自由基的清除作用随浓度增大而有较大幅度的增强，且在高浓度的试验条件下，LEO的DPPH自由基清除作用逐渐接近其主要组分的单体物质。黄娜娜[14]53研究发现柑橘精油中的γ-萜品烯在100 μL/mL浓度下的DPPH自由基清除率达75.8%，远高于同浓度的柠檬烯(DPPH自由基清除率9.7%)、α-松油醇(DPPH自由基清除率4.1%)等其它成分。Choi H等[15]测得γ-萜品烯(浓度为227.9 mg equiv. Trolox/mL)的DPPH自由基清除率为84.7%，高于d-柠檬烯和α-松油醇的8.8%～16.5%清除率，并测得尤力克柠檬、里斯本柠檬、塔提希岛酸橙等34种柑橘类精油的DPPH自由基清除率为17.7%～64.0%，低于同浓度的γ-萜品烯，却高于同浓度的d-柠檬烯和α-松油醇；且其研究还表明含γ-萜品烯越多的精油有越强的DPPH自由基清除作用。陈思佳等[13]测得6 mg/mL 柠檬烯对DPPH自由基清除率仅为56.08%，远低于2.25 mg/mL柠檬精油99.47%的DPPH自由基清除率，说明柠檬精油中存在其它具有清除自由基作用的成分，且这些成分对精油的抗氧化活性可能存在相互促进或抑制的内在关系。因此，鉴于本试验结论与上述研究结论的异同，对植物精油和其组分间的抗氧化活性比较，还需进一步从单体纯度、单体结构(如柠檬烯有d-柠檬烯、l-柠檬烯、dl-柠檬烯3种不同结构形式)、单体相互间的作用等方面进行多因素探讨。

图2 α-松油醇、γ-萜品烯、dl-柠檬烯和LEO 清除DPPH自由基能力

Figure 2 Ability ofα-terpineol、γ-terpinene、dl-limonene and LEO scavenging DPPH

2.2 抑菌活性

醇类、酚类、萜烯类、酮类及其衍生物等是挥发性精油的主要抑菌成分[19]，但因其在结构上的差异，对微生物的抑菌作用有较大差别[20-21]。

2.2.1 单体成分的抑菌效果 细胞壁干扰和破坏细胞膜完整性的建议性机制表明：柠檬烯刺激基因表达与细胞壁完整性信号通路有关；因此，d-柠檬烯可改变细胞壁特性和干扰隔膜形成，引起细胞分裂，从而起到抑菌或杀菌的作用[22]。α-松油醇也可通过破坏细胞壁、抑制细菌酶活性、抑制某些调节基因产物的翻译而发挥抗菌作用[23]。总体来说，精油不同单体成分的抑菌活性会因抑菌条件、微生物类型[如细菌(致病菌、非致病菌)、酵母、霉菌]等因素影响而表现出千差万别。

LEO主要成分单体物质的抑菌效果见表1。由表1可知，纯LEO对3种供试菌表现出较强的抑制作用，相比其3种主要组分的单体物质有更好的抑菌效果，与Hong L[24]、Antonio B[25]等的研究结论一致，说明植物精油中具抑菌效果的化学组分种类较多，需对不同成分间的相互影响开展深入探讨。就LEO单体物质而言，α-松油醇较dl-柠檬烯和γ-萜品烯对3种供试菌有更佳的抑菌效果，且其抑制作用的强弱次序为大肠杆菌>枯草芽胞杆菌>金黄色葡萄球菌；dl-柠檬烯对枯草芽孢杆菌的抑制作用最佳，其次为金黄色葡萄球菌；γ-萜品烯在试验条件下仅对枯草芽孢杆菌表现出一定的抑菌作用。但也有研究[26]表明，5 mg/m3浓度的松油醇(由α-松油醇65%+β-松油醇10%+γ-松油醇20%组成)可使空气中的细菌数量减少68%，高于γ-萜品烯的40%灭菌率。

表1 α-松油醇、dl-柠檬烯、γ-萜品烯和LEO的抑菌效果

2.2.2 单体成分复配的抑菌效果 精油单体成分在一定条件下的抑菌作用会受到其它单体成分的影响，并表现出协同或弱化2种截然相反的作用：如百里香精油具有广谱抗真菌活性可能是因其所含的35.7%α-松油醇所致，也可能是α-松油醇与其所含的其它成分协同作用的结果[27]；而柚子精油和甜橙精油中的某些成分会降低dl-柠檬烯抑制黄曲霉的能力[28]。在前期单体复配物的抑菌试验基础上，选取浓度为1 μL/mL 的α-松油醇、dl-柠檬烯和γ-萜品烯按一定体积比复配后的抑菌效果分别见表2～4。

表2复配物对枯草芽孢杆菌的抑菌效果

Table 2 Antimicrobial effects of compound combined withα-terpineol,dl-limonene andγ-terpinene onBacillussubtilis

复配形式抑菌圈直径/mmγ⁃萜品烯+α⁃松油醇13．34±0．93γ⁃萜品烯+dl⁃柠檬烯11．34±0．60α⁃松油醇+dl⁃柠檬烯12．58±0．28γ⁃萜品烯+α⁃松油醇+dl⁃柠檬烯11．04±0．11

表3复配物对金黄色葡萄球菌的抑菌效果

Table 3 Antimicrobial effects of compound combined withα-terpineol,dl-limonene andγ-terpinene onStaphylococcusaureus

复配形式抑菌圈直径/mmγ⁃萜品烯+α⁃松油醇8．06±0．30γ⁃萜品烯+2dl⁃柠檬烯9．48±0．19α⁃松油醇+2dl⁃柠檬烯9．54±0．20γ⁃萜品烯+α⁃松油醇+2dl⁃柠檬烯9．63±0．06

表4复配物对大肠杆菌的抑菌效果

Table 4 Antimicrobial effects of compound combined withα-terpineol,dl-limonene andγ-terpinene onE.coli

复配形式抑菌圈直径/mmγ⁃萜品烯+2dl⁃柠檬烯9．40±0．34γ⁃萜品烯+3α⁃松油醇13．86±0．402dl⁃柠檬烯+3α⁃松油醇13．98±0．23γ⁃萜品烯+2dl⁃柠檬烯+3α⁃松油醇14．00±0．21

对比表1中各单体物的抑菌圈测定结果，表2～4的测定结果表明单体复配物较单体本身对各供试菌的抑菌效果总体上更佳。尤其是试验条件下对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌不具抑制作用的γ-萜品烯与dl-柠檬烯和α-松油醇复配后，能进一步增强dl-柠檬烯和α-松油醇的抑制效果。另一方面，3种单体物质按一定比例两两复配后对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制作用弱于三者复配的；而两两复配的单体物质对枯草芽孢杆菌的抑制作用则明显强于三者复配的。

3 结论

(1)α-松油醇、γ-萜品烯、dl-柠檬烯与LEO对OH·的清除效果较为接近，但这3种单体成分较LEO有更强的DPPH自由基清除作用；由此可推断精油化学成分间某些形式和某种程度的组合会在一定程度上降低精油本身的抗氧化活性，这需要今后进一步研究证实。

(2)α-松油醇、γ-萜品烯和dl-柠檬烯对枯草芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制强弱次序不一，且对这3种测试菌的抑制效果均弱于LEO；而三者间的组合物较其单体的抑菌作用更佳。对于这3种单体物质更大范围比例组合后的抑菌效果，以及与其它精油组分复配后的抑菌效果、作用方式、作用机制等，则需更深入地探讨研究，以更好地阐释不同精油成分间的内在关联，为更精准地筛选精油具抗氧化、抑菌等生理活性的主要目标成分提供更好的试验参考和理论依据。

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