Bruton酪氨酸蛋白激酶在创伤性休克诱发的全身炎症反应中研究与思考

刘欣伟， 柳云恩， 王 宇

沈阳军区总医院 骨科 全军重症战创伤救治中心，辽宁 沈阳 110016

·骨科专题·

Bruton酪氨酸蛋白激酶在创伤性休克诱发的全身炎症反应中研究与思考

刘欣伟， 柳云恩， 王 宇

沈阳军区总医院 骨科 全军重症战创伤救治中心，辽宁 沈阳 110016

Bruton酪氨酸蛋白激酶； 创伤性休克； 全身炎症反应综合症； 多器官功能障碍综合征； 脓毒症

Bruton′s tyrosine kinase; Traumatic shock; Systemic inflammatory response syndrome; Multiple organ dysfuction syndrome; Pyohemia

Bruton酪氨酸蛋白激酶(Bruton tyrosine kinase，Btk)是非受体酪氨酸蛋白激酶Tec家族成员之一，是Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)信号通路的一个重要信号分子，但其在体内炎症反应中的作用仍知之甚少。由于TLRs信号通路在创伤后全身炎症反应综合征(systemic inflammatory response syndrome，SIRS)和多器官功能障碍综合征的发生发展过程中具有重要作用。Btk信号可能通过激活下游促炎性信号通路，参与创伤后全身炎症反应和重要脏器损伤的发病过程。本研究对目前该领域的文献进行回顾、分析并进行了思考，通过复制小鼠创伤性休克模型，观察Btk激酶在各脏器中的表达及活化，并以腹腔巨噬细胞和肺泡巨噬细胞为研究对象，采用慢病毒载体RNA干扰方法研究Btk在内毒素诱导的MAPK和NF-κB活化及细胞因子表达中的作用；采用过继巨噬细胞实验研究Btk在创性休克诱发的全身炎症反应和肺损伤中的作用和机制，这也许是一种可行的研究思路。本研究旨在加深对Btk的认识，与国内外先进理念接轨，从而为创伤后SIRS的防治提供新的思路。

创伤是重要的全球性公共卫生问题，在美国及西方国家，创伤是1～44岁人群死亡的首位原因，在我国，创伤也是当今青壮年人群的第一位死亡原因[1]。低血容量循环衰竭是导致创伤患者伤后即刻死亡和早期死亡的的主要原因，而其诱发的SIRS、脓毒症及多器官功能障碍综合征(multiple organ dysfunction syndrome，MODS)则是创伤患者晚期死亡最重要的原因。创伤性休克的防治一直是创伤急救领域的研究重点和热点，其中，围绕SIRS开展的创伤性休克的研究工作在世界各国广泛地进行。失控的SIRS被认为是导致脓毒症和MODS的主要致病机制，而SIRS与过量的炎性介质产生有关。然而，到目前为止，针对细胞因子等炎性介质的抗炎治疗在SIRS、脓毒症及MODS患者中进行的所有临床研究均失败了。研究炎性介质过度释放的信号转导机制，并对关键信号通路进行调控，对于阻断创伤性休克失控性炎症反应可能较针对某一单个炎症介质更为有效。

TLRs是一类病原分子识别受体家族，其不仅能识别病原体相关分子模式(pathogen associated molecular patterns，PAMPs)，其某些成员，尤其是TLR4也可识别无菌性损伤后释放的众多内源性分子即损伤相关分子模式(DAMPs)。外源脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)或内源性配体与TLR4结合后，活化MyD88和TRIF两条信号途径，前者活化NF-κB和MAPK信号通路，后者活化NF-κB和干扰素调节因子3信号通路。TLR4通过这些信号途径诱导产生一系列的炎症介质，包括细胞因子、趋化因子等，从而产生强有力的炎症和免疫反应。通过调控TLRs信号转导通路可调节炎性免疫反应，干预脓毒症的发展。近年来，有研究表明，TLR4及其信号通路介导的天然免疫在创伤后局部和全身炎症反应的发生、发展的动态过程中具有重要作用[2]。在失血性休克、股骨骨折、创伤性休克等动物模型中，TLR4在局部炎症反应、远隔脏器损伤、全身炎症反应中发挥了重要作用。TLR4在脓毒症病理生理过程中的重要作用提示，针对TLR4可能形成抗炎治疗靶点。然而，近年来的临床研究结果表明，应用TLR4特异性拮抗剂TAK-242(Ⅲ期临床试验)和E5564(Ⅱ期临床试验)并不能从细胞因子水平降低严重脓毒症患者的病死率[3-4]。进一步探索参与创伤性休克后SIRS发生的新的信号转导机制，对脓毒症和MODS的防治及提高创伤患者的存活率均具有重要意义。

Btk是胞浆非受体酪氨酸蛋白激酶Tec家族成员之一，是B淋巴细胞发育所必需的物质。Btk突变可致人X连锁无丙种球蛋白血症，患者体内缺乏抗体和成熟的外周B淋巴细胞[5]。Btk是第一个被发现的Tec激酶家族成员，该家族成员还包括Tec、Itk、Bmx及Txk，其结构与Src激酶家族类似，由PH结构域、Tec同源区、SH3、SH2及激酶结构域组成，其N端缺乏疏水性跨膜结构，而C端缺乏负性调节区。有研究发现，Btk是TLR4及TLR2、6、7、8、9等信号传递中的关键信号分子[6-7]。当LPS等TLRs配体作用于细胞时，Btk由胞浆迅速移位至胞膜并发生酪氨酸磷酸化而具有激酶活性，活化的Btk可磷酸化多个接头蛋白，如MyD88、Mal/TIRAP、IRAK-1及TRIF，并与这些接头分子相互作用形成复合体，复合体进一步募集下游信号分子TRAF6。在泛素连接酶UEVIA和UBCl3的催化作用下，TRAF6发生一系列的泛素化反应，支架蛋白TAB2和TABl介导TRAF6向下传导信号[8-10]。通过上述机制，Btk可增强TLR信号转导并最终激活NF-κB和MAPKs信号通路，继而启动炎性基因表达[11]。有研究表明，Btk基因突变或缺失的单核/巨噬细胞、肥大细胞和外周血单个核细胞对LPS刺激不敏感，TNF-κ、IL-1κ和iNOS表达明显下降，进一步研究发现，Btk对细胞因子表达的调控作用主要是通过NF-κB和p38激酶介导的[12-16]。

虽然体外研究证实，Btk在LPS/TLR4信号转导中具有重要地位，但体内研究却显示内毒素血症时，Btk基因缺陷小鼠病死率不仅没有预期下降，反而明显增加，同时伴有IL-10合成减少，IL-6水平升高[17-18]。造成体外与体内研究结果截然相反的原因，笔者推测可能主要是由于Btk(-)小鼠体内缺乏LPS天然IgM抗体，从而导致LPS清除障碍，LPS作用被持续放大[17]；其次可能是由于Btk(-)小鼠缺乏B淋巴细胞，从而导致IL-10产生不足，间接导致IL-6水平升高，造成炎症失控。有研究发现，B淋巴细胞TLR4信号通路活化后可产生大量IL-10，从而抑制促炎性细胞因子的产生，在天然免疫中发挥重要的调理作用[19]；另外，也可能是由于Btk基因和Tec家族其他成员基因之间具有明显的冗余和代偿功能[20]，导致Btk(-)小鼠无法显示表现型，从而掩盖了Btk的真实作用。Btk(-)基因敲除小鼠的这些先天性内在缺陷，可能是导致当前未见文献报道利用Btk(-)小鼠进行脓毒症研究的原因。目前，关于Btk信号通路与炎症关系的研究仍多限于体外观察，在体内炎症反应中的调控作用仍知之甚少。

与其他炎性信号分子如TLR4、NF-κB、MAPKs及细胞因子等广泛分布表达于体内各种不同类型细胞不同，Btk的细胞表达谱较窄，仅限于髓系细胞，包括B淋巴细胞、单核/巨噬细胞、树突状细胞、粒细胞及肥大细胞，但不表达于T淋巴细胞[21]。Btk基因缺失的单核/巨噬细胞、中性粒细胞、树突状细胞及B淋巴细胞与野生型比较，在体外并未表现出增殖抑制和凋亡易感性增加[22]。这些提示，抑制Btk信号对机体免疫功能的不利影响可能远低于抑制其他信号分子的影响。鉴于Btk信号在启动细胞免疫炎性反应的重要性及其在炎性细胞中的特异性表达，Btk很可能是创伤性休克时SIRS、脓毒症及MODS的理想干预靶点。

脓毒症所致的MODS中，肺是最早发生衰竭的器官，表现为急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征(ALI/ARDS)。ALI以炎性介质过度分泌、炎性细胞大量浸润、肺血管内皮细胞及肺泡上皮细胞广泛损伤为病理特征，临床表现为急性呼吸窘迫、难治性低氧血症及非心源性肺水肿，是导致脓毒症患者死亡的主要原因。肺泡巨噬细胞是肺固有的巨噬细胞，约占肺巨噬细胞总数的80%，与肺间质巨噬细胞及其他脏器固有的巨噬细胞，如肝Kupffer细胞不同，其处于肺泡腔内，肺泡壁将其与循环系统隔离出来。肺泡巨噬细胞活化可分泌大量炎性介质，并启动循环单核/巨噬细胞及多性核中性白细胞向肺内浸润。肺泡巨噬细胞在肺内炎症反应的启动和加剧过程中发挥了重要作用，是参与ALI发生的关键效应细胞。由于炎症反应是ALI发病的病理生理学基础，Btk作为众多炎性介质合成与释放的重要上游信号转导通路，可能在创伤后肺泡巨噬细胞活化及ALI的发生与发展过程中发挥了重要作用。

笔者认为，为了寻找更高效、具有特异性的抗炎靶点以防治失控性SIRS，可以研究Btk信号通路在创伤性休克时全身炎症反应及急性肺损伤发病中的作用和机制。通过建立小鼠创伤性休克模型，观察Btk激酶在各脏器中的表达及活化情况，并采用Btk特异性抑制剂LFM-A13进行体内干预实验，以探讨其在全身炎症和脏器损伤中的作用，这将是一个较好的研究切入点。

另外，由于单核/巨噬细胞是参与创伤脓毒症时全身炎症反应的主要效应细胞，肺固有的肺泡巨噬细胞也在脓毒症ALI发生中起着至关重要的作用，为阐明Btk信号分子作用机制，也以分离培养的腹腔巨噬细胞及肺泡巨噬细胞为研究对象，采用慢病毒载体RNA干扰方法研究Btk在内毒素诱导的MAPK和NF-κB活化及细胞因子表达中的作用。为了进一步明确Btk在创伤性休克诱发的全身炎症反应及急性肺损伤中的特异性作用和机制，有必要采用分子生物学手段阻断体内Btk活化，但由于Btk表达局限于炎性细胞，而炎性细胞在活体内尚无法像上皮细胞一样进行转染，为此可以将体外转染了RNA干扰慢病毒载体的腹腔巨噬细胞和肺泡巨噬细胞分别进行全身的过继细胞免疫治疗实验，以达到高效特异性阻断体内巨噬细胞及肺泡巨噬细胞Btk活化的目的。

通过结合体内和体外实验，采用RNA干扰、慢病毒载体转染、Western blotting，EMSA、real time PCR等手段，深入研究Btk信号通路在创伤性休克时全身炎症反应及急性肺损伤中的作用及分子机制，这将有助于阐明严重创伤后失控性炎症反应的发生机制，为创伤后脓毒症和多脏器功能衰竭的防治提供新的思路和线索。

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国家自然科学基金(81401586)

刘欣伟(1979-)，男，黑龙江哈尔滨人，副主任医师，博士

王 宇，E-mail：deformitya@126.com

2095-5561(2017)03-0145-03 DOI∶10.16048/j.issn.2095-5561.2017.03.05

2016-12-22