免疫组化技术、原位杂交技术用于结核病诊断中的价值评价

喻永洋

免疫组化技术、原位杂交技术用于结核病诊断中的价值评价

喻永洋

目的 探究免疫组化技术、原位杂交技术用于结核病诊断中的应用价值,评价其效果。方法 结核病患者142例作为结核病组,另选取100例进行健康体检的志愿者作为健康组。结核病组患者随机分为A、B组,各71例,A组进行免疫组化技术诊断,B组进行原位杂交技术诊断,观察两种方法在显微镜下的病变形态,比较两种诊断方法的检测阳性率。结果 A组和健康组的阳性率分别为87.32%、6.00%,B组和健康组的阳性率分别为97.18%、2.00%。B组诊断结核病的阳性率高于A组,差异具有统计学意义 (χ2=4.829,P＜0.05)。结论 免疫组化技术、原位杂交技术都是结核病诊断较好的手段,但原位杂交技术诊断结核病的阳性率高于免疫组化技术,具有临床推广价值。

免疫组化技术 ； 原位杂交技术 ；结核病； 诊断

结核病主要是由于结核杆菌侵袭患者机体脏器引起的慢性传染病,其中以肺部感染最为常见。结核杆菌感染患者后,使患者机体抵抗力降低,出现发热、乏力、消瘦、呼吸困难等各种疾病,严重者会引发患者发生肺癌等疾病,影响患者的生命安全和身体健康。有研究表明,早期对患者进行治疗,能有效降低患者的感染率,缩短传染期,降低复发率,因此寻找一种准确可靠的诊断方法具有至关重要的意义。本次研究对比了免疫组化技术和原位杂交技术在诊断结核病中的效果,现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2014年12月～2016年3月本院收治的明确诊断为结核病的患者142例作为结核病组,另选取100例在本院进行健康体检的志愿者作为健康组。本次研究经过患者及志愿者本人同意并经过本院伦理委员会批准进行。健康组,男56例,女44例,年龄21～73岁,平均年龄(41.29±10.58)岁。142例结核病组患者随机分为A、B组,各71例,其中A组：男41例,女30例,年龄23～72岁,平均年龄(48.73±8.76)岁,病程1～6个月,平均病程(3.91±0.72)个月,结核感染部位：肺结核37例、淋巴结核21例、其他13例；B组：男39例,女32例,年龄24～71岁,平均年龄(47.88± 7.93)岁,病程1～5个月,平均病程(3.77±0.48)个月,结核感染部位：肺结核39例、淋巴结核18例、其他14例；A、B两组患者的性别、年龄及结核感染部位比较,差异无统计学意义(P＞0.05),具有可比性。

1.2 检验方法

1.2.1 A组 行免疫组织化法：①石蜡标本制作：将结核病组和健康组标本取样后立即放入10%福尔马林中浸泡24 h,之后分别用70%(4 h)、80%(4 h)、90%(3 h)乙醇及无水乙醇(2 h)脱水处理,处理后的标本用二甲苯(PX)进行透明处理2 h；最后除杂质后,放入纯石蜡中,4℃保存待用。②制片：将①中的石蜡切成厚度为4 μm切片,放置于载玻片上滴1 ml蒸馏水,在恒温水浴锅上烘干。③组织切片在PX中浸泡10 min,梯度乙醇浸泡5 min脱水后；PX透明处理3 min。④PBS冲洗5 min×3次,将过氧化氢的甲醇溶液滴在标本上静置。12 min,消除内源性过氧化物酶的影响；PBS液洗5 min×3次后封闭处理,室温30 min后倾出多余液体。⑤加入适量一抗,在4℃下过夜,次日PBS洗3次各5 min。⑥加入相应的二抗后静置15 min,PBS洗3次。⑦DAB显色：在组织标本上滴加DBA显色剂并在显微镜下观察染色程度,PBS冲洗10 min。⑧苏木精复燃4 min后用不同浓度酒精脱水后冲洗10 min。⑨PX处理后,XSP-4C光学显微镜下观察；⑩PBS取代一抗制备的阴性对照。

1.2.2 B组 行原位杂交诊断法：①根据结核杆菌设计特异结核探针,由上海纳昂达生物科技有限公司合成。②制作石蜡切片标本,并浸泡在0.8%盐酸胃蛋白酶液中,37℃消化10～15 min［1］。③TBS洗3次,5 min/次,依次用100%～70%梯度乙醇浸泡5 min脱水后,室温晾干。④滴加步骤：设计的探针,98℃变性10 min,在冰水混合物中退火,在37℃孵育1 h,TBS洗3次,滴加碱性磷酸酶标记的地高辛抗体,室温放置0.5 h,专用染液洗3次。⑤滴加NBT/BCIP的碱性磷酸酶的底物缓冲液避光显色,核快红衬染5 min,中性树胶封片镜检［2］。

1.3 观察指标 观察两种诊断方法的标本镜检下的形态,并计算阳性率。

1.4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

免疫组化技术和原位杂交技术制片后在显微镜下观察到标本的病变部位的胞质内出现黄色或棕色颗粒。A组和健康组的阳性率分别为87.32%、6.00%,B组和健康组的阳性率分别为97.18%、2.00%。B组诊断结核病的阳性率高于A组,差异具有统计学意义 (χ2=4.829,P＜0.05)。见表1。

表1 两种诊断方法阳性率结果(n,%)

3 讨论

结核病是WHO和我国重点防治的重大传染病,目前我国结核病年发病人数约为130万,占全球发病的14.3%,位居世界第二［3］。该病传播途径广泛,可通过空气、食物、垂直传播等途径进行传播,危害较大且持续时间长,给患者造成巨大的心理和生理负担。随着科学技术的发展,抗结核药物—利福平、异烟肼相继合成,全球结核病患者大幅减少。但自20世纪80年代以来,人类免疫缺陷病毒(HIV)感染者不断增多及抗药性结核病菌株的产生,结核病已被WHO列为人类的主要杀手［4］。结核分枝杆菌细长略弯曲,聚集呈分枝状排列繁殖,细胞壁含有大量脂质(占菌体干重的40%～60%),在细胞壁中最多,大量的脂质使一般的消毒剂难以渗入胞内,表现为对外界环境有超常的抵抗力,对酸、碱、自然环境和干燥环境有抵抗力,对湿热、酒精、紫外线敏感；此外,结核分枝杆菌的形态、菌落、毒力及耐药性均可发生变异,导致耐药性增强出现耐药菌株及耐多药菌株,给治疗带来困难。目前对于结核病的治疗,临床上主张早期诊断,及时确诊并制定治疗措施,以防结核杆菌造成机体其他脏器的破坏［5-8］。临床上诊断结核病使用X线、病理切片、抗酸染色等方法。但X线影像仪器复杂,成本高,且准确率不高,常会出现误诊或漏诊。抗酸染色法,具有病理特征检测准确等优势,但检测时间长,特异性低,会出现假阴性等状况,限制了其在临床上的应用［9,10］。随机分子生物学技术的发展,基因工程和蛋白工程在疾病诊断方面的影响日益扩大,本次研采用的免疫组化技术利用特异性抗体与结核杆菌中的相关蛋白结合进行检测,而原位杂交技术通过设计特异性探针,通过碱基互补原理与结核杆菌特异性结合进行检测,两种方法较传统的诊断方法特性性更高。

本次研究结果显示：免疫组化技术和原位杂交技术制片后在显微镜下观察到标本的病变部位的胞质内出现黄色或棕色颗粒。A组和健康组的阳性率分别为87.32%、6.00%,B组和健康组的阳性率分别为97.18%、2.00%。B组诊断结核病的阳性率高于A组,差异具有统计学意义 (χ2=4.829,P＜0.05)。

综上所述,两种方法都是结核病诊断较好的手段,原位杂交技术诊断结核病的阳性率高于免疫组化技术,具有临床推广价值。

［1］刘泳冬,梁英杰,刘妮,等.免疫组化与原位杂交双标记技术在鼻咽癌诊断中的应用.临床医学工程,2014,21(3):288-289.

［2］李雪梅,张平英,程安春,等.免疫组化和原位杂交技术检测人工感染PRRSV猪体内病毒定位的比较.动物医学进展,2013,34(6):8-12.

［3］阮远,张孝斌,程帆,等.量子点免疫荧光对比传统免疫组化技术检测人前列腺组织中前列腺特异性抗原的表达.武汉大学学报(医学版),2013,34(2):188-191.

［4］赵艳姣,刘新兰,秦璟.FISH及免疫组化技术检测乳腺癌Her-2基因与蛋白的临床应用价值.宁夏医学杂志,2013,35(7):586-588.

［5］陈泽慧,刘华庆,肖庆帮,等.巢式PCR、原位杂交、免疫组化技术在结核病诊断中的应用价值.中华医院感染学杂志,2009,19(24):3442-3445.

［6］杨建萍,宫亚红,冯秀芳.应用免疫组化SP和原位杂交技术检测非妊娠期及妊娠期尖锐湿疣组织中HPV DNA.临床医学,2002,22(7):50-51.

［7］毕晓芳,陈利萍.免疫组化和原位杂交联合应用在尖锐湿疣临床诊断中的价值.宁夏医学杂志,2008,30(6):529-530.

［8］肖庆邦,王海青,郭瑞珍.两种显色方法在免疫组化和原位杂交技术中应用.临床与实验病理学杂志,2012,28(11):1288-1289.

［9］姜长青.原位核酸杂交技术与免疫组化在宫颈病变HER-2/ neu、HPV、P16检测中的应用价值.青岛大学,2007.

［10］杨春青,张炜明,李百周.免疫组化与原位杂交双标记技术的方法学研究.南京医科大学学报(自然科学版),2004,24(3):316.

10.14164/j.cnki.cn11-5581/r.2017.03.023

2016-08-23］

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