卵巢浆液性腺癌中SP1、KLF4和p21表达及其预后意义

张 军，汪瑞雪，樊晓妹，娄 蕾，刘围娜，赵喜娃，李月红

卵巢浆液性腺癌中SP1、KLF4和p21表达及其预后意义

张 军1，汪瑞雪1，樊晓妹1，娄 蕾2，刘围娜2，赵喜娃1，李月红2

目的探讨不同级别卵巢浆液性腺癌中 SP1、KLF4和 p21蛋白表达的差异和预后意义。方法应用免疫组化 EliVision法检测卵巢低级别和高级别浆液性腺癌中 SP1、KLF4和 p21蛋白的表达，Kaplan-Meier单因素和 Cox多因素生存分析其与患者预后的关系。结果SP1、KLF4和 p21蛋白在高级别浆液性腺癌中的阳性率分别为 74.5%、17.0%和 11.7%，低级别浆液性腺癌中的阳性率分别为65.2%、34.8%和26.1%，与对照组相比，SP1表达均明显升高（P＜0.05），而KLF4和p21表达均明显降低（P＜0.05）。三者在高、低级别液性腺癌中的表达差异无显著性（P＞0.05）。SP1、KLF4和 p21蛋白表达与高级别液性腺癌FIGO分期密切相关，且SP1还与术后有无残留灶密切相关（P＜0.05）。卵巢高级别液性腺癌中SP1表达与KLF4、p21的表达均呈显著负相关（P＜0.05）。高级别液性腺癌中 SP1蛋白阳性者的5年生存率明显低于阴性者，而 KLF4和p21蛋白阳性者的5年生存率明显高于阴性者（P＜0.05）。Cox多因素分析显示，FIGO分期和 SP1高表达是影响高级别浆液性腺癌预后的独立因素。结论SP1蛋白过表达以及 KLF4和 p21蛋白低表达，参与了高、低级别浆液性腺癌的发生，三者表达与高级别浆液性腺癌的预后有关，且 SP1是独立预后因素。

卵巢肿瘤；浆液性腺癌；SP1；KLF4；p21；预后

卵巢浆液性腺癌是卵巢上皮性恶性肿瘤中最常见的一种肿瘤，其预后与临床分期、病理类型、细胞分化程度、术后残存癌灶大小及肿瘤细胞对化疗的敏感性有关。目前寻找特异的预后指标和分子靶向治疗是治疗卵巢癌的首要任务。SP1是 Sp／KLF家族中的转录因子，作为癌基因参与调控多种基因的表达，如VEGF、MMP和FOXM1。KLF4是近年发现的一种锌指样转录因子，与SP1在锌指的C-端具有高度同源性，但作用于不同的靶基因，可表现为转录激活或抑制，在多数肿瘤细胞中 KLF4为抑癌基因。已有报道证实 SP1与KLF4在胰腺癌、胃癌中的表达呈负相关。p21是p53基因下游靶基因的转录产物，其低表达与许多肿瘤的发生密切相关，SP1可能参与其转录和调控。本文检测 SP1、KLF4和 p21蛋白在卵巢不同级别浆液性腺癌中的表达情况，探讨其在不同分级浆液性腺癌中的作用，分析其与临床病理特征、预后的关系及应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料收集2003年7月 ～2011年1月河北医科大学第二医院妇产科行手术治疗的卵巢高级别浆液性腺癌94例，患者术前均未行放、化疗，具有完整临床资料及随访记录。其中Ⅰ＋Ⅱ期26例，Ⅲ＋Ⅳ期68例；手术后行化疗66例，未化疗28例；术后无残留灶31例，有残留灶 63例；平均年龄 55岁。另选取低级别浆液性腺癌 23例，其中Ⅰ＋Ⅱ期 6例，Ⅲ＋Ⅳ期17例；平均年龄48岁。低、高级别腺癌分别选择20例正常卵巢和输卵管组织作为对照组。

1.2 方法（1）主要试剂：SP1、KLF4、p21兔抗人多克隆抗体均购自 Proteintech公司；Rabbit Streptavidin-HRP试剂盒购自北京康为世纪公司；DAB显色试剂盒购自北京中杉金桥公司。（2）免疫组化：采用免疫组化SP法染色，具体操作步骤按试剂盒说明书进行，阳性对照选择已知的阳性病理切片，阴性对照选择磷酸盐缓冲液（PBS）代替一抗。

1.3 结果判定SP1、KLF4和 p21蛋白表达位于细胞核，阳性细胞数 ＜10%为（－），10%～25%为（＋），25%～50%为（⧺），＞50%为（⧻）。

1.4 统计学方法计数资料的比较选用 χ2检验或者Fisher确切概率；多个样本率的两两比较采用 χ2分割，Spearman法分析SP1、KLF4、p21蛋白表达的相关性；运用 Kaplan-Meier单因素生存分析法绘制生存曲线，计算生存率；Log-rank法比较生存差异。Cox风险回归模判断卵巢浆液性腺癌的独立预后因素，检验水准α＝0.05。

2 结果

2．1 SP1、KLF4和p21蛋白在卵巢浆液性腺癌中的表达高级别浆液性腺癌组中 SP1蛋白阳性率74.5%，显著高于正常输卵管组（P＜0.05）。低级别浆液性腺癌组中SP1蛋白阳性率65.2%，显著高于正常卵巢组（P＜0.05）。高级别浆液性腺癌组中KLF4 和p21蛋白阳性率分别为17.0%和11.7%，均显著低于正常输卵管组（P＜0.05）。低级别浆液性腺癌组中 KLF4和p21蛋白阳性率分别为34.8%和26.1%，均显著低于正常卵巢组（P＜0.05）。SP1、KLF4和p21蛋白在卵巢高、低级别浆液性腺癌组中的阳性率差异无显著性（P＞0.05，表1，图1～3）。

表1 SP1、KLF4和p21在卵巢不同级别浆液性腺癌中的表达

2．2 SP1、KLF4和 p21蛋白表达与卵巢浆液性腺癌临床病理特征的关系高级别浆液性腺癌Ⅲ＋Ⅳ期患者中 SP1蛋白阳性率显著高于Ⅰ＋Ⅱ期，而KLF4和p21蛋白阳性率显著低于Ⅰ＋Ⅱ期，差异有统计学意义（P＜0.05）。术后残留灶患者的SP1蛋白阳性率显著高于无残留灶者（P＜0.05）。SP1、KLF4和 p21蛋白表达与患者年龄和是否有网膜转移无明显相关性（P＞0.05，表2）。低级别浆液性腺癌组中SP1、KLF4和 p21蛋白表达与患者年龄、FIGO分期和是否有网膜转移无明显相关性（P＞0.05）。卵巢高级别浆液性腺癌组中 SP1与 KLF4 和 p21蛋白表达呈显著负相关性（P＜0.05），低级别浆液性腺癌组中 SP1与 KLF4和 p21蛋白表达无明显相关性（P＞0.05）。

2．3 SP1、KLF4和 p21蛋白表达与卵巢浆液性腺癌预后的关系有随访的94例高级别浆液性腺癌患者中，SP1蛋白阳性组和阴性组的5年生存率分别为2.9%和50.0%，差异有显著性（P＜0.05）。KLF4蛋白阳性组和阴性组的 5年生存率分别为31.2%和 11.5%，差异有显著性（P＜0.05）。p21蛋白阳性组和阴性组的 5年生存率分别为 45.5% 和10.8%，差异有显著性（P＜0.05）。有随访记录的23例低级别浆液性腺癌患者中，SP1、KLF4和p21蛋白阳性组和阴性组的5年生存率差异无统计学意义（P＞0.05，图4）。

图1 A.高级别浆液性腺癌中SP1蛋白呈阳性，SP法；B.低级别浆液性腺癌中SP1蛋白呈阳性，SP法 图2 A.正常输卵管中KLF4蛋白呈阳性，SP法；B.正常卵巢上皮中KLF4蛋白呈阳性，SP法 图3 A.正常输卵管中p21蛋白呈阳性，SP法；B.正常卵巢上皮中p21蛋白呈阳性，SP法

2．4 卵巢不同级别浆液性腺癌 Cox多因素生存分析高级别浆液性腺癌患者 Kaplan-Meier法分析结果显示，除SP1、KLF4和p21外，FIGO分期、网膜转移、手术后化疗和术后残留灶也是影响患者 5年生存率的重要因素。Cox多因素分析结果显示，SP1高表达、FIGO分期进入Cox比例风险回归模型，是影响卵巢高级别浆液性腺癌患者的独立预后因素（P＝0.000，P＝0.005），而 KLF4、p21低表达、网膜转移，术后化疗和术后残留灶未能进入Cox比例风险回归生存分析模型，不是影响卵巢高级别浆液性腺癌患者预后的独立因素（表3）。低级别浆液性腺癌患者 Kaplan-Meier法和 Cox多因素分析结果显示，FIGO分期是影响患者预后的独立因素（P＜0.05），而SP1、KLF4和p21及网膜转移、手术后化疗和术后残留灶不是影响患者预后的独立因素。

表2 SP1、KLF4和p21蛋白表达与卵巢高级别浆液性腺癌临床病理特征的关系

表3 Cox回归模型中各变量的相关参数值

图4 高级别浆液性腺癌患者的5年生存率比较 A.SP1；B.KLF4；C.p21

3 讨论

卵巢浆液性腺癌特别是高级别浆液性腺癌病死率高，预后差。SP1是序列特异性的 DNA结合蛋白，SP1的异常表达和活化可促进相关肿瘤生长因子和血管生成基因的表达，为肿瘤生长营造适宜的局部微环境，促进肿瘤的增殖、转移和血管生成。研究表明［1－3］：SP1可以与 CD147相互作用形成正反馈调节，促进卵巢癌细胞的侵袭能力，与低氧诱导因子（hypoxia inducible factor，HIF）相互协同、活化多种基因，使卵巢癌细胞适应低氧等不利的微环境，可以上调血管内皮生长因子的表达，促进肿瘤的血管和淋巴管生成。研究还发现SP1活化可以诱导卵巢癌细胞磷脂结合的表皮生长因子样生长因子的表达，从而对化疗药物产生耐药［4］。KLF4与 SP1同属于 SP1／KLFs家族，在细胞的增殖、分化、胚胎发育过程中起重要作用，并与多种肿瘤的发生有关。近年发现，KLF4作用于不同的靶基因，可以表现为癌基因或抑癌基因功能。Hu等［5］发现，在肺癌中KLF4通过抑制hTERT和MAPK信号通路，发挥抑癌作用。Yoon等［6］发现，卵巢上皮性癌中 KLF4蛋白表达明显降低。p21是目前研究较多的抑癌基因之一，p21表达既可呈 p53依赖型，也可不依赖于p53途径，非依赖 p53途径即直接导致细胞异常增殖或恶变，与肿瘤发生密切相关。Ye等［7］发现，鼻咽癌中CIC3可以抑制p21蛋白表达，从而提高Cyclin D1-CDK4／6表达，促进肿瘤的发生。文献报道［8］，上调 p21蛋白表达可明显抑制MMP2和MMP9的表达，进而抑制乳腺癌细胞的浸润和转移。KLF4和 SP1在 C-端的3个锌指基因结构具有高度同源性，KLF4通过与 SP1竞争结合上游的GC盒结合位点对组氨酸脱羧酶的表达产生抑制［9］。Shie等［10］报道在直结肠癌中，SP1高表达能使 KLF4完全失去对 Cyclin D1启动子活性的抑制作用，进而促进直肠癌的发生。有报道指出胞质中 p21的表达与卵巢癌的耐药性有关［9］，具体机制还有待进一步分析。

於永爱等［11］研究表明，SP1蛋白在不同组织类型的卵巢癌中表达升高，而且与临床分期和肿瘤分化明显相关，与转移无明显相关性。本实验免疫组化结果证实了SP1蛋白在卵巢低、高级别浆液性腺癌中均呈高表达，但两者之间差异无显著性。分析可能是卵巢癌不同组织学类型发生、发展存在较大差异，本实验以不同级别浆液性腺癌为分析对象，排除其他类型的可能影响，提示 SP1在卵巢浆液性癌发生中起促进作用，既参与低级别浆液性腺癌的发生，也参与高级别浆液性腺癌的发生。Chen等［12［13］发现，miR-572过表达可以抑制p21蛋白表达，从而促进卵巢癌细胞的增殖。本组实验结果证实p21蛋白在卵巢浆液性腺癌中表达降低，提示其在卵巢浆液性腺癌的发生、发展中主要起抑癌基因作用，且在不同级别间差异无显著性。卵巢低级别腺癌中，SP1 与 KLF4、p21的表达无明显相关性；卵巢高级别浆液性腺癌中 SP1表达与 KLF4、p21的表达均呈显著负相关，提示 SP1表达可能通过某种机制对 KLF4 和 p21的表达起抑制作用，但是在不同组织中的作用机制可能不同。本组实验也发现，SP1、KLF4和p21蛋白表达与高级别浆液性腺癌的 FIGO分期密切相关，且 SP1还与术后有无残留灶密切相关。但KLF4和p21蛋白表达与患者年龄、网膜转移和术后残留灶无明显相关性；三者与低级别浆液性腺癌的各临床病理特征之间无明显相关行，分析可能与样本量较小有关，待进一步扩大样本量深入分析。总之，三者的表达与卵巢浆液性癌的发生密切相关，但不同级别之间并无明显差异，高、低级别浆液性腺癌发生仍然存在许多共同的分子基础。

卵巢浆液性腺癌患者预后的相关传统因素较多，目前寻找独立的分子预后指标仍然是临床研究工作的热点，SP1、KLF4和 p21蛋白表达与高级别浆液性腺癌患者预后的研究尚未见报道。本实验发现 FIGO分期、网膜转移、手术后化疗、术后残留灶、SP1、KLF4和 p21蛋白是影响高级别浆液性腺癌患者预后的重要因素，但Cox多因素生存分析结果表明，只有FIGO分期和SP1高表达是影响卵巢高级别浆液性腺癌预后的独立因素。提示 FIGO分期是影响高级别浆液性腺癌的独立预后因素，而 SP1、KLF4和 p21蛋白表达以及网膜转移、手术后化疗、术后残留灶对低级别浆液性腺癌的5年生存率均无明显影响，分析可能与样本量较小有关，需要进一步扩大样本量深入分析。

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Expression and prognostic significance of SP1，KLF4 and p21 in ovarian serous carcinoma

ZHANG Jun1，WANG Rui-xue1，FAN Xiao-mei1，LOU Lei2，LIUWei-na2，ZHAO Xi-wa1，LIYue-hong2
（1Department of Gynecology，the Fourth Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050011，China；2Department of Pathology，the Second Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050000，China）

PurposeTo explore the difference of expression and prognostic significance of SP1，KLF4 and p21 in low grade ovarian serous carcinoma（LGSC）and high grade ovarian serous carcinoma（HGSC）.M ethodsThe expression of SP1，KLF4 and p21 protein was examined with immunohistochemistry EliVision method in caseswith LGSC and HGSC.Kaplan-Meier analysis and Cox multivariate survival analysis were used to assess the impact of SP1，KLF4 and p21 expression on prognosis of LGSC and HGSC.ResultsSP1，KLF4 and p21 expression were detected respectively in 74.5%，17.0%and 11.7%HGSC cases，and in 65.2%，34.8%and 26.1%LGSC cases. Compared to control group，the expression level of SP1 was significantly higher（P＜0.05），but the expression level of KLF4 and p21 were significantly lower（P＜0.05）.There was no significant difference of SP1，KLF4 and p21 expression between HGSC and LGSC（P＞0.05）.The expression of SP1，KLF4 and p21 were associated with FIGO stage，meanwhile SP1 associated with residual tumor size in HGSC（P＜0.05）.Therewas a significant negative correlation between SP1 and KLF4，p21 proteins in HGSC（P＜0.05）.Kaplan-Meier analysis revealed that there were significantly poor overall survival（OS）of 5 years for patients with HGSC displaying high expression of SP1，or low expression of KLF4 and p21（P＜0.05），but no significantly improved OS for patients with LGSC（P＞0.05）.Cox analysis showed that SP1 overexpression is an independent prognosis factor for HGSC.ConclusionOverexpression of SP1 and low expresion of KLF4 and p21 contribute to carcinogenesis of HGSC and LGSC.They are associated with a poor prognosis of HGSC，but not LGSC，meanwhile SP1 is an independant prognosis factor for HGSC.

ovary neoplasm；serous adenocarcinoma；SP1；KLF4；p21；prognosis

R 737.31

A

1001－7399（2017）01－0022－05

10.13315／j.cnki.cjcep.2017.01.006

接受日期：2016－12－02

河北省科技支撑计划（16277794D）

1河北医科大学第四医院妇科，石家庄 0500112河北医科大学第二医院病理科，石家庄 050000

张 军，女，博士，副主任医师。E-mail：sjzzhangjun1998＠126.com李月红，男，主任医师，教授，通讯作者。E-mail：liyuehong1993＠126.com