论牛冷冻精液人工授精技术

单曲拉姆 泽旺曲珍 索朗曲吉

（1.西藏自治区农科院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850000；2.西藏自治区拉萨市尼木县吞巴乡农牧综合服务中心，西藏拉萨 850000）

论牛冷冻精液人工授精技术

单曲拉姆1泽旺曲珍2索朗曲吉1

（1.西藏自治区农科院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850000；2.西藏自治区拉萨市尼木县吞巴乡农牧综合服务中心，西藏拉萨 850000）

牛冷冻精液人工授精是一项具有重大科学价值的繁殖新技术，它是建立在家畜育种工作的迫切需要和人工授精技术高度发展基础上的。近代生理学、生物化学、分子生物学、低温学、化工学、电子学以及超声波技术的进展，为精液的冷冻保存，运输和使用技术，提供了现代化的技术装备。该项技术不仅在畜牧生产上获得了显著的效益和广泛的应用，而且迅速扩大到其它生物贮存和其它科学领域，如农业、工业、医疗卫生等。

1 牛冷冻精液的生产程序

要生产出高质量冷冻精液，除了引进或选留优良公牛及科学的饲养管理以外，在冻精生产过程中必须严格操作规程。现将其生产程序作一介绍：

根据生产性能的需要选留种公牛并进行科学的饲养管理，等至合适的年龄时，即可进行采精调教至正式生产，其工艺流程为：采精器械准备及稀释液的配制→人工采集精液→鲜精活力镜检 0.6级以上→鲜精液稀释2－4倍→降温平衡→镜检平衡后活力→制冻→镜检冻后活力0.3级以上→分装贴标→保存→输精。

2 液氮、冻精的保存及运输

液氮、冻精均存放于低温生物容器（液氮罐）内，液氮罐是用不锈钢或铝合金制成的双层外壁容器，内外两层中间为高度真空并填有绝热材料，容器盖用泡沫塑料制成，即可少量透气，又有隔热作用。因为液氮的沸点很低（ -195.8℃），所以往空罐内填充液氮时，开始要缓慢少量，待罐内温度降低后，再逐步加大流量及速度，液氮、冻精贮存罐每年倒空1－2次自然放置60－70小时，使罐内温度回升到常温，然后用清水冲洗干净，并加以干燥。

液氮罐内有精液贮存时，注意当液氮耗量达到60－70%时。就要补充液氮，防止因缺少液氮而使罐内温度回升导致精子死亡。贮存液氮和冻精的液氮罐应放置在阴凉、干燥、通风透气条件较好的房间内。运输液氮和冻精时，严禁用任何物品将罐口封严，以堵塞液氮的自然挥发量而使罐内产生较高压力而发生冲爆事故、危及安全。不论使用何种交通工具运输液氮和冻精，均不得严闭车窗口，因为罐内液氮随时地都处于微量自然挥发状态，如通风透气条件不好，则室内空气中氮气含量增加，氧气含量减少，会造成乘坐人员因缺氧而发生窒息事故。

3 冻精液的解冻技术和解冻方法

冷冻精液的解冻过程与冷冻过程比较，虽然方法简单，速度快，时间短，但同样重要，解冻的温度变化与冷冻相反，温度是由低到高，同样应避免或减少在通过结晶危险温度区精子细胞膜内发生变化而对精子造成损伤甚至死亡。

3.1 颗粒冻精的解冻技术和解冻方法

1）解冻液的配制

我省目前使用的解冻液为2.9%的柠檬酸钠（Na3C6H5O7、2H2O）溶液，大部分人工授精站都是统一从省育种站购买，也有少部分地区自制生产，不论是购买或自己配制，都必须严格生产过程中的操作规程。统一配方并调定准确有关参数（PH值，渗透压）。现将配方及配制方法介绍如下：

准量称取柠檬酸钠 2.9克，放入玻璃量筒内加蒸馏水至100毫升刻度，混合均匀，测定PH值为7.33，渗透压290.3，经定量滤纸过滤，分装于安瓿内，每只安瓿内的净溶量为1.5毫升，用酒精灯火焰封口，然后置于高压消毒锅中消毒灭菌（蒸气1.06－1.4kg/cm2，消毒时间为20－40分钟，蒸气温度为121－126℃），保存在阴凉干燥处待用，有效期为6个月。安瓿解冻液的优点是便于保管，卫生，能减少外界环境污染，取用方便。据了解，有的单位使用的解冻液是自行配制后盛装于三角烧瓶中保存备用，这种方法保存的时间短，接触外界污染机会多，取用不便，而且质量很难保证。建议各地使用安瓿法解冻液，以保证冻精解冻后的质量。

2）解冻温度

冷冻精液的解冻温度分为快速解冻（40℃），室温解冻（15－20℃），冷水（4－5℃）缓慢解冻三种方法。目前世界上大部分地区都采用35－40℃这个温度范围解冻，实践证明，采用40℃快速解冻精子复苏率较高，且活力较强。

3）解冻技术操作

解冻过程中必须严格各个环节的操作过程，注意以下事项：a、冻精离开液氮面与放入解冻液中的速度一定要快取快放，尽量缩短空间停留时间；b、颗粒冻精上不得粘附冻霜，如有应稍加振动，使其脱落后再行解冻；c、解冻过程的各个环节，必须严格控制环境污染；d、夹取颗粒冻精的金属镊子要经预冷后再夹取冻精，以防止颗粒冻精粘附在镊子上难以脱落。

3.2 解冻具体操作步骤

首先将恒温容器（电热恒温水溶锅或广口保温杯）内的水温调至 40℃±2℃，将装有解冻液的安瓿放入温水内，等其温度与恒温水大约相等时，即将安瓿拿出，用消毒纱布抹去安瓿周围的水分，再用安瓿开口器或金属镊子将安瓿尖端开口，口径大小以能放入一颗冻精为宜，然后夹取一颗冻精放入安瓿的三分之二，在水中轻缓游动，使安瓿内的颗粒冻精温度均匀上升，游动安瓿时必须特别小心，绝对不能将恒温水振入安瓿内，观察颗粒大约溶解至80－90%时，即可将其拿出水面，再次用消毒纱布擦去安瓿周围的水分，并略加摇动，使精液完全溶解，混合均匀，然后在20℃左右温度的显微镜下检查精子活力情况，如有效精子（呈直线前进运动的精子）的活力在0.3级以上，即可用于输精。

3.3 细管冻精的解冻技术和解冻方法

在使用细管精液过程中，首先必须按照冷冻精液的规程操作，虽然细管冻精不易受外界环境污染，但标准化、规范化的技术操作也是确保受胎率，避免生殖系统感染病菌的重要措施。

1）检查细管体

细管冻精从液氮中取出后，首先检查细管体是否有裂纹和封口不严的现象，如发现有裂纹者，该支细管冻精应弃之不用，如属封口不严，则解冻时可封口不严的一端朝上放入40℃左右的恒温水中进行解冻，尽量避免因解冻方法不当而导致解冻后精子活力不强乃致死亡的人为因素。

2）解冻

首先准备 40℃左右的恒温水，恒温容器的准备与颗粒冻精解冻法介绍的相同，细管冻精从液氮中取出后，手拿细管上端（封装精液后封口），立即放入恒温水中并轻缓游动，以保持其管壁受热均衡。经20－30秒钟后即可解冻完毕。目前全国各地较为普遍使用此种解冻方法的解冻效果好且受胎率高，除此种方法外，也有其它几种方法可供参考，但不提倡广泛使用。

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1003-1650(2017)04-0251-01