中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基因克隆与序列分析

刘巧英++李梦歌++刘雪飞++余昊++王运兵

摘要：采用兼并引物和RACE的技术，在中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis Jakovlev）中获得丝氨酸蛋白酶的全长cDNA序列，将该基因命名为ASJSP，cDNA全长为958 bp，开放阅读框为885 bp，推测编码295个氨基酸，预计分子量为31.20 kDa，等电点pI为9.38，预测分子式为C1 374H2 222N390O407S15，不稳定系数为31.94，总亲水性系数为0.114，为疏水性稳定蛋白质。序列分析表明ASJSP与其他盲蝽科昆虫已知丝氨酸蛋白酶的核苷酸序列一致性为55.70%。

关键词：中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis Jakovlev）；丝氨酸蛋白酶；RT-PCR；序列分析

中图分类号：S433.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）21-5659-05

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.056

Cloning and Sequence Analysis of Serine Proteinase of Adelphocoris suturalis Jakovlev

LIU Qiao-ying， LI Meng-ge， LIU Xue-fei， YU Hao， WANG Yun-bing

（School of Resourse and Environment Science，Henan Institute of Science and Techology，Xinxiang 453003，Henan，China）

Abstract： RT-PCR with degenerate primers and RACE were used to amplify partial cDNA fragments and full cDNA，one serine protease gene from Adelphocoris suturalis Jakovlev was identified， designated ASJSP. The full-length cDNAs of ASJSP is 958 bp，this gene contains 885 bp open-reading frames（ORF） which encodes a putative 295 amino acid protein，with a predicted molecular mass of 31.20 kDa and isoeletric point（pI） of 9.38. Its predicted molecular formula is C1 374H2 222N390O407S15. Bioinformatical analysis showed that it is a instability index is 31.94 and the GRAVY 0.114，suggesting that it is a stable hydrophobic protein. Sequences analysis showed that ASJSP had 55.70% identity with complete serine protease genes from other Miridae insects.

Key words：Adelphocoris suturalis Jakovlev；serine proteinase；RT-PCR；sequence analysis

絲氨酸蛋白酶主要消化昆虫食物中的蛋白质类营养物质，并参与合成与降解昆虫体内的蛋白质，是大多数昆虫消化系统内较为重要的消化酶，其主要包含弹性蛋白酶、胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶等[1-5]。目前，已有一些关于半翅目盲蝽科昆虫的丝氨酸蛋白酶方面报道，研究发现Lygus rugulipennis和Creontiades dilutus等盲蝽科昆虫唾液中富含胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶类[6-9]，豆荚盲蝽Lygus Hesperus唾液腺内的总蛋白酶活性也以胰蛋白酶活性为主[10-12]。Zhu等[13]发现美国牧草盲蝽取食后，主要依靠其唾液腺内的丝氨酸蛋白酶先进行初步消化，之后其他肠道内的蛋白酶进一步消化，吸收蛋白质类营养物质，且丝氨酸蛋白酶的活性占其唾液腺内总蛋白酶活性的80%。以上研究结果说明，在半翅目昆虫消化系统内丝氨酸蛋白酶是较重要的消化酶。

中黑盲蝽（Adelphocoris suturalis Jakovlev）为半翅目盲蝽科昆虫，是中国一种重要的盲蝽类害虫，广泛分布于长江流域和黄河流域[14]。中黑盲蝽的寄主植物种类众多，已报道有100余种，包括棉花等多种作物[15]。20世纪90年代末，由于农业产业结构调整以及Bt棉花广泛种植减少化学农药的使用等原因，中黑盲蝽种群数量上升、为害加重，成为中国棉花等作物的主要害虫[16-19]。由于其食性杂、天敌控制作用弱、寄主广泛及行动敏捷等特点，在作物大面积生产时增加了一定的防控测报难度。虽然，在一些半翅目盲蝽科植食性昆虫种类上，针对丝氨酸蛋白酶类消化酶已进行了分子生物学方面的研究，如豆荚盲蝽Lygus hesperus及美国牧草盲蝽，但是目前关于中黑盲蝽的研究国内鲜见报道。本研究采用RT-PCR和RACE技术，克隆中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基因的cDNA序列ASJSP，并对其进行初步分析，以期为中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶的分子消化机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试虫源：中黑盲蝽成虫采自河南省新乡县，采回后在实验室用新鲜四季豆人工饲养，室内温度条件（26±0.5） ℃，相对湿度60%～70%，光周期16∶8 h（L∶D）。饲养密度为40～60头/盒，供试所用昆虫为羽化后的中黑盲蝽成虫。

1.2 试剂和仪器

主要试剂：RNA提取试剂盒（REeasy Mini Kit）购自QIAGEN公司。cDNA第一链合成试剂盒（PrimerScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）购自宝生物工程有限公司。胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit）购自OMEGA公司。Marker Ⅱ、Marker Ⅲ购自TIANGEN公司。DEPC购自上海索莱宝科技有限公司。50×TAE缓冲液购自上海双螺旋生物科技有限公司。其他所用化学试剂为国产分析纯。

仪器：Neofuge 13R型高速台式冷冻离心机；Tgradient型梯度PCR仪；JY600C型君仪电泳仪和JY-SP-BT型电泳槽；Tanon3500型Tanon凝胶成像系统；SkanIt RE for Multiskan GO 3.2型全波长酶标仪；Eppendorf移液枪；PYX-300Q-A型智能光照培养箱；JJ-CJ-1FD型超净工作台。

1.3 试验方法

1.3.1 中黑盲蝽总RNA的提取 将实验室饲养的中黑盲蝽成虫置于1.5 mL预冷的离心管中，加适量液氮研磨至粉末，按照RNA提取试剂盒（REeasy Mini Kit）的具体方法提取中黑盲蝽总RNA。

1.3.2 中间片段的获取 cDNA的第一链合成按试剂盒（PrimerScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit）说明书进行。PCR反应体系包括DEPC-treat water 34.75 μL，10×PCR Buffer 5 μL，10 mmol/L dNTPs 4 μL，正向引物2 μL，反向引物2 μL，cDNA 2 μL，Taq酶0.25 μL。PCR反应热循环参数：预变性94 ℃ 3 min；94 ℃变性 30 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸10 min，34个循环；72 ℃延伸10 min。正向引物序列：5′-TCGTCCAAGCCGACTCAT-3′。反向引物序列：5′-ACGCAGATAGCAGCACA-3′。

1.3.3 全長cDNA的获取 3′端cDNA扩增：反应采用3′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Invitrogen）推荐的方法进行， 以总RNA为模板，反转录酶合成cDNA。再以反转录产物为模板，用引物5′-GCCTCTTCCATCAACTTCAAC-3′与通用引物UAP配对扩增3′端。PCR产物稀释100倍作为模板，用上游引物5′-AGAACTCTGACTGTTTGTCCG-3′与下游引物UAP进行第二次PCR，扩增产物回收、测序。

5′端cDNA 扩增：按照5′RACE System for Rapid Amplification of cDNA Ends（Version 2.0）推荐方法进行，以总RNA为模板，用引物5′-CAAGGGTGTATCTGTTG-3′，在反转录酶催化下合成cDNA。转录产物经S.N.A.P纯化后进行TdT 加尾。最后，以加尾产物为模板，用引物5′-GGTGGTGTCAAGTTTC

TTTGG-3′与通用引物AAP进行5′端扩增。

1.3.4 PCR产物的回收与序列测定 PCR扩增产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，在凝胶成像系统中观察并保存结果，切割目的条带按照凝胶回收试剂盒（Gel Extraction Kit）的方法回收PCR产物，并于-20 ℃保存回收目的产物。最后，将纯化后的PCR产物送生工生物工程有限公司进行测序。

1.4 数据分析

采用Blast获得的全长cDNA序列，使用Clustalx1.8 软件对这些序列进行比对。采用软件MEGA4.0进行Kimura双参数遗传距离分析，构建NJ进化树，Bootstrap估算重复1 000次，检验分子系统树各处的置信度。利用TMPRED软件（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）预测跨膜结构；采用ExPASy生物信息学资源网站的ProtParam工具（http：//web.expasy.org/protparam/）分析基本理化性质及Protscale工具（http：//ca.expasy.org/tools/protscale.html）分析疏水性；使用SignalP工具（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）预测信号肽。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取及测序结果

通过检测，提取的中黑盲蝽成虫RNA的OD260 nm/OD280 nm值为1.926，当OD260 nm/OD280 nm>1.8时，说明样品纯度较高，可以满足后续试验的要求。

经测序，得到中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶cDNA基因，命名为ASJSP，长度为958 bp，推测其开放阅读框为885 bp，编码295个氨基酸，以ATG为起始密码子，以TAG为终止密码，结果如图1所示。

2.2 序列同源性分析

由图2可知，中黑盲蝽ASJSP与其他盲蝽科昆虫已知丝氨酸蛋白酶的蛋白序列的一致性为55.70%。ASJSP与Creontiades dilutus（登录号：AAL15154.1）的一致性为84.41%；与绿盲蝽Apolygus lucorum（登录号：AFX73399.1）的一致性为32.93%；与其他盲蝽科的丝氨酸蛋白酶蛋白序列的一致性均大于31.64%。

2.3 不同目丝氨酸蛋白酶的系统发育树

应用MEGA4.0软件Neighbor Joining（NJ）法对包括ASJSP在内的10种不同种类昆虫的丝氨酸蛋白酶进行系统发育进化树的构建（图3）。结果显示，膜翅目、鞘翅目、半翅目昆虫丝氨酸蛋白酶较为分化，位于不同的分支上，可能与该目昆虫食性的不同及繁多的种有一定关系。中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶ASJSP先与Creontiades dilutus聚在一起，又跟绿盲蝽Apolygus lucorum聚在一起，说明中黑盲蝽与Creontiades dilutus（登录号：AAL15154.1）进化关系最近，与绿盲蝽Apolygus lucorum（登录号：JQ609682.1）进化关系次之，与其他7种昆虫的进化关系较远。

2.4 中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基本理化性质预测分析

通过ExPASy生物信息学资源网站的ProtParam工具推测中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶的基本理化性质，发现此蛋白质共包含295个氨基酸，预测分子式为C1 374H2 222N390O407S15，理论分子量为31.20 kDa，等电点pI为9.38，不稳定系数为31.94，摩尔消光系数为33 055，总平均亲水性系数为0.114，故推测此蛋白质为稳定的疏水性蛋白质。使用TMPRED软件预测跨膜结构，发现其有3个跨膜区，分别位于第1～20，59～76和198～215位，故推测该蛋白质为跨膜蛋白质。使用SignalP工具对信号肽进行预测，发现中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基因ASJSP所编码的蛋白质具有信号肽结构，该信号肽位于1～20位氨基酸残基处。

3 讨论

通過RT-PCR和RACE技术获得了丝氨酸蛋白酶基因的全长cDNA序列ASJSP。通过对比氨基酸序列的同源性，ASJSP与其他盲蝽科昆虫已知丝氨酸蛋白酶的氨基酸序列的一致性为55.70%，与Creontiades dilutus（登录号：AAL15154.1）的一致性最高，推测获得的克隆蛋白序列是丝氨酸蛋白酶家族中的一员。经过生物信息学分析，推测中黑盲蝽丝氨酸蛋白酶基因ASJSP所编码的蛋白质是一个疏水蛋白质，信号肽的切割位点可能是前20位氨基酸。

研究表明，丝氨酸蛋白酶是昆虫消化系统中较为重要的蛋白酶。如华北大黑鳃金龟（Holotrichia oblita）的丝氨酸蛋白酶HoSP1、棉铃虫（Helicoverpa armigera）的丝氨酸蛋白酶Ha-TLP及桔小实蝇（Bactroceran）的丝氨酸蛋白酶BdorSer，这些酶在消化系统中均发挥重要作用[20-22]。绿盲蝽（Apolygus lucorum）取食不同的寄主植物后，其丝氨酸蛋白酶基因AlSP3和AlSP4在不同性别成虫的体内表达量均有明显差异[23，24]。为深入地探究中黑盲蝽的消化系统中丝氨酸蛋白酶的作用，本研究获得中黑盲蝽的丝氨酸蛋白酶基因，同时为以后研究中黑盲蝽体内的消化代谢提供理论基础。

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