正交试验优化仙桃草总黄酮提取工艺

2017-03-18肖秋香彭湘君李银保

湖北农业科学 2016年21期

肖秋香++彭湘君++李银保

摘要：通过单因素试验和正交试验对仙桃草（Veronica anagallis-aquatica L.）中总黄酮的提取工艺进行优化。结果表明，仙桃草中总黄酮提取的最佳工艺条件为提取溶剂55%的乙醇、提取温度65 ℃、提取时间90 min。在最佳工艺条件下仙桃草总黄酮提取率达0.270 1%。

关键词：仙桃草（Veronica anagallis-aquatica L.）；总黄酮；正交试验

中图分类号：R282.2 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）21-5588-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.21.038

Optimize the Extraction Technology of Total Favonlids in Veronica anagallis-aquatica L. by Orthogonal Experiment Method

XIAO Qiu-xianga， PENG Xiang-junb， LI Yin-baob

（a.College of Basic Medical；b.College of Pharmacy，Ganan Medical University，Ganzhou 341000，Jiangxi，China）

Abstract：The extraction technology of total flavonoids in Veronica anagallis-aquatica L. were optimized by single factor test and orthogonal test. The results showed that the best extraction process conditions in Veronica anagallis-aquatica L. for total flavonoid were 55% of ethanol，65 ℃ and 90 minutes of extraction time. Under the optimum process of conditions，total flavonoid yield can reach to 0.270 1%.

Key words： Veronica anagallis-aquatica L.；flavonoids；orthogonal test

仙桃草（Veronica anagallis-aquatica L.）是玄参科植物，也称为蚊母草、接骨草。在中国东北、华东、华中、西南各省均有分布。仙桃草中含有原儿茶酸、木犀草素、香草酸、金圣草素、甘露醇等多种有效成分。带虫瘿的仙桃草全草入药，具有活血止血，消肿止痛等功能，适用于跌打损伤、瘀血肿痛、骨折挫伤、各种出血等病症[1，2]。仙桃草中的木犀草素具有抗肿瘤[3]、抗菌[4]、抗炎[5]、增强免疫、解痉、祛痰、保护心血管系统[6]等作用；金圣草素还具有抗过敏、抗炎等作用，这两种化合物均具有黄酮母核。

总黄酮提取方法較多[7，8]。本试验通过考察提取温度、乙醇体积分数、提取时间对仙桃草总黄酮提取率的影响，采用正交试验法获得仙桃草中总黄酮的最优提取工艺，以期为仙桃草资源的经济、合理利用提供有效的方法。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

材料：仙桃草，产地为安徽。

试剂：芦丁标准品，天津一方科技有限公司；无水乙醇（AR，99.7%），天津市福晨化学试剂厂；石油醚（AR），天津福晨化学试剂厂；正丁醇（AR），上海润捷化学试剂有限公司。

仪器：JA5003型电子天平购于上海市安亭电子仪器厂；WF-4000型微波快速反应系统购于上海屹尧分析仪器有限公司；RE-52AA型旋转蒸发器购于上海亚荣生化仪器厂；Lambda 35型UV/VIS分光光度计购于Perkin Elmer公司；DHG-9070A型电热恒温干燥箱购于邦西仪器科技（上海）有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 芦丁标准品的制备精确称取0.006 0 g芦丁标准品，加入少量正丁醇溶解，转至250 mL容量瓶中加正丁醇定容摇匀，静置2 min。分别取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL上述芦丁溶液置于25 mL比色管中，用正丁醇定容后待测得到标准曲线。

以正丁醇为参比溶液，用紫外可见分光光度计在200～700 nm扫描芦丁标准品，得到最大吸收波长为208 nm，因此使用此波长为检测波长。

1.2.2 标准曲线的建立以芦丁系列标准品溶液体积分数X为横坐标，吸光度Y为纵坐标，建立相应的直角坐标系。用最小二乘法求得线性回归方程，Y=0.198 4X-0.010 8，R=0.993 9，如图1所示。

1.2.3 仙桃草总黄酮提取称取一定量干燥的仙桃草细粉，加入乙醇用微波提取，提取液用四层纱布过滤，残渣同法再操作一次，合并滤液。抽滤，取滤液旋转蒸发至小于50 mL，加乙醇定容至100 mL备用。

取上述备用溶液，加入5倍体积的无水乙醇， 4 ℃静置过夜，抽滤除去沉淀。取滤液旋转蒸发至50 mL左右，加入2倍体积蒸馏水，转移至分液漏斗中，用2倍体积的石油醚萃取3次，取下层溶液，再用2倍体积的正丁醇萃取3次，取上层溶液，将萃取液旋转蒸发小于50 mL，用正丁醇定容至100 mL待测。测量时准确吸取1.000 mL待测液于50 mL容量瓶中，用正丁醇定容至刻度待用。

1.2.4 总黄酮含量测定以正丁醇为参比溶液，将上述仙桃草总黄酮提取液用紫外可见分光光度计208 nm处测定其吸光度。再将吸光度代入芦丁标准品的线性回归方程计算总黄酮提取率。

提取率=×100%

式中，m为仙桃草细粉质量，c为待测液浓度。

1.2.5 单因素试验分别考察提取温度、乙醇体积分数、提取时间对仙桃草总黄酮提取率的影响。 ①提取温度对仙桃草总黄酮提取率的影响：65%的乙醇，提取30 min，设定提取温度分别为45、55、65、75、85 ℃；②乙醇体积分数对仙桃草总黄酮提取率的影响：65 ℃下提取30 min，提取2次，设定乙醇体积分数分别为45%、55%、65%、75%、85%；③提取时间对仙桃草总黄酮提取率的影响：65%的乙醇，65 ℃下提取2次，设定提取时间分别为15、30、60、90、120 min。

1.2.6 正交试验方法在单因素试验的基础上，选取提取温度、乙醇体积分数、提取时间进行3因素3水平正交试验，试验因素和水平见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 提取温度对仙桃草总黄酮提取率的影响由图2可知，随着提取温度的升高，仙桃草中总黄酮提取率不断增大，其中提取温度在45～55 ℃，提取率变化最大。超过55 ℃时，提取率趋于平稳。

2.1.2 乙醇体积分数对仙桃草总黄酮提取率的影响由图3可知，仙桃草中总黄酮提取率先升高后降低，可见乙醇体积分数对提取率的影响较大。在65%的乙醇提取时，提取率达到峰值。取55%、65%、75%这3水平进行正交试验。

2.1.3 提取时间对仙桃草总黄酮提取率的影响由图4可知，仙桃草总黄酮提取率随提取时间的延长先升高，后缓慢降低。试验采用的是微波提取，提取效率较高，而且提取了两次。15～30 min，随着提取时间的延长提取率明显升高。提取时间延长，可溶性杂质增加。植物蛋白质、可溶性多糖析出增多，醇沉吸附总黄酮增多。30 min后，提取率变化不明显。

2.2 正交试验结果

由表2可知，3个因素对对仙桃草总黄酮提取率的影响从大到小为乙醇体积分数>提取温度>提取时间，提取仙桃草总黄酮的最优工艺组合为55%的乙醇，提取温度65 ℃，提取时间90 min。

3 小结

采用微波提取法提取黄酮类化合物，与传统工艺相比提取时间短、乙醇用量少、提取效率高較。本试验将提取次数定为2次，料液比定为1∶10（m∶V）。

采用正丁醇溶解标准品并制作样品，是考虑到正丁醇对总黄酮的提取比乙醇水溶液更有针对性，能最大限度避开仙桃草中可溶性杂质的影响。对仙桃草总黄酮溶液的扫描也证实了这一观点。样品与标准品的紫外吸收峰形状相似，在208 nm处表现出强烈的紫外吸收。

通过正交试验确定采用提取温度65 ℃、提取时间90 min、乙醇体积分数55%进行仙桃草总黄酮的提取，总黄酮提取率较高。其中，乙醇体积分数是影响黄酮类化合物最重要的因素。与传统浸提法相比，微波提取大大缩短了工作时间，提高了产量。

参考文献：

[1] 谢万宗.全国中草药汇编[M].北京：人民卫生出版社，1975.

[2] 宋立人.中华本草[M].上海：上海科学技术出版社，1999.

[3] 肖大凯，覃燕梅，莫丽儿，等.木犀草素对卵巢癌细胞株转移能力的影响[J].中国病理生理杂志，2006，22（6）：1199-1202.

[4] 迟晓喆，曹光群.桑叶总黄酮的提取及其抑菌活性研究[J].林产化学与工业，2012，32（2）：163-166.

[5] 张毅，王旭光.木犀草素的体外抗炎机制研究[J].广州中医药大学学报，2007，24（3）：231-234.