寨卡病毒与登革热病毒交叉反应抗体引发严重性疾病的关系

严延生，翁育伟

寨卡病毒与登革热病毒交叉反应抗体引发严重性疾病的关系

严延生1,2,3，翁育伟1,3

登革病毒(DENV)不同血清型感染后，易导致抗体依赖增强反应(ADE)的严重性疾病发生。2015年5月巴西流行寨卡病毒(ZIKV)后，截止至2016年11月，流行已扩散到60多个国家和地区，毗邻我国的一些东南亚国家也有报告ZIKV感染病例。近期有研究显示，ZIKV和DENV的包膜(E)蛋白EDI和EDII两表位引发的抗体或由此产生的单克隆抗体具有很强的交叉反应性，易引起ADE的发生。我国沿海省份历年时有DENV病毒流行，今后ZIKV流行事件极有可能发生，因此，由该病毒流行引起的严重性疾病发生我们必须要关注和提出应对措施。

登革病毒；寨卡病毒；交叉反应蛋白；严重性疾病

Supported by Chinese national high technology research and development program(No.2011AA02A114)

寨卡病毒(Zika virus，ZIKV)与登革病毒(Dengue virus，DENV)感染，除前者已有报道可引起出生缺陷如小头症(Microcephaly)、神经系统疾病如格林巴氏综合征(Guillain-barre syndrome)外，这两种病毒的单独感染大多表现为轻症。但近期一些在国际上影响力很大的期刊报道了实验室所做的ZIKV和DENV先后相互感染可能因抗体依赖的增强感染作用(antibody-dependent enhancement，ADE)而引发严重性疾病[1-5]的报道，除个别理论有相互矛盾外，其研究、设计及结果均属上乘。那么，这两种病交互感染、相互影响在多大程度上产生严重临床后果？这值得我们关注。

登革热是我国重点关注的季节性传染病。受东南亚等国家流行的影响，我国一直有登革热的输入，并造成东南沿海地区常发生登革热的流行甚至暴发[6]。除在中、南美洲发生流行外，2016年ZIKV已经在东南亚发生并新加坡等国家流行[7]，我国也已报道发现27例输入性病例。2017年夏季及以后年份，我国东南沿海地区流行ZIKV的可能性是存在的。因此，我们需要了解ZIKV流行的后果，以做必要的防备。

1 近期ZIKV和DENV的疫情

2015年巴西流行寨卡病毒(ZIKV)，世界卫生组织(WHO)于2016年2月1日宣布寨卡病毒疫情为“国际关注的突发公共卫生事件”。截止至2016年11月18日，流行已扩散到60多个国家和地区。虽然WHO宣称该病毒不再构成国际突发公共卫生事件，但该病毒仍具有“高度影响及长期问题”。

寨卡病毒感染的主要途径是由埃及伊蚊、白蚊伊蚊等叮咬引起，但也可通过性传播及垂直传播途径感染[8-11]。大多数寨卡病毒病表现为无症状或轻症感染，但有证据表明ZIKV感染可引起神经系统并发症如格林巴氏综合征、小儿小头症等先天性出生缺陷综合症等，这些疾病的产生可能与ZIKV感染人神经前体细胞有关[12-13]。更为严重的是，由DENV与ZIKV病毒诱导的血清抗体存在严重交叉反应，不同病毒的持续感染可能导致ADE效应的发生，从而导致ZIKV的感染可引发登革热流行地区的严重性寨卡病毒病的发生；反之亦然，DENV在寨卡病毒病流行区的流行，也可引发登革热严重性疾病的发生，如登革出血热(Dengue hemorrhagic fever，DHF)或登革休克综合征(Dengue shock syndrome，DSS)。

2 抗体依赖增强感染作用(ADE)

ADE的产生是由于具反应性但非中和性的抗病毒抗体通过抗体的Fc段，介导病毒侵犯宿主细胞，导致细胞的感染性增强现象。一些非容许(non-permissive)细胞缺乏特异性病毒结合受体，但具有Fc结合受体，因此，病毒-抗体复合物可通过抗体Fc段，结合到细胞表面，引起病毒内吞，从而导致细胞感染，该现象在细胞培养实验室很常见，但除登革热外，在其他活体上很少见。病毒可以利用这个机制感染人的免疫细胞，从而引起一系列轻度到危重疾病的发生[14]。

DENV有4 种血清型，即DENV1～4。DENV 感染后可产生多种抗体。通常DENV感染可产生对该型病毒终身免疫的IgG中和抗体，可保护同型再感染不引起疾病。同型病毒的中和抗体衰减很慢，大多由长寿记忆性B细胞产生。机体也可产生对异型DENV的交叉保护抗体，但这种交叉保护IgG中和抗体逐渐衰减，最长可在4～20年后消失。除了产生中和抗体外，DENV感染也可产生部分中和或者完全不中和病毒的所谓病毒反应性抗体，这种反应性抗体对异型DENV非但没有中和病毒的作用，反而像电脑的“木马”病毒那样，骗过了树突状细胞(或是被另一系的树突状细胞误读)，使其发生胞噬作用将病毒裹入细胞内，病毒在白细胞内繁殖而造成高病毒血症，使疾病恶化[15]，这种感染作用即是所谓登革热ADE发生的机制。或许，发生在古巴的一次事件，可以真实、典型的说明登革热ADE的现象。

1977-1979年，古巴曾发生过登革热的流行，当时流行的病毒血清型系DENV1。此次流行后，该国又分别于1981和1997年发生两次DENV2引起的流行。在1997年流行中[16]，发现报告了205例DHF/DSS病例，所有病例均大于15岁，除3个病例外，202个病例均在1977-1979年感染过DENV1，该病例数3-4倍于发生在1981年的DHF/DSS病例。这恰恰说明了在1981年时，不少病例体内还存在着1977-1979年感染后产生的异源中和抗体，所以1981年时发生DHF/DSS病例少；而到了1997年，异源中和抗体衰减至已不能保护异型感染，因此发生了多数DHF/DSS病例[17]。

3 ZIKV和DENV的交叉反应性

ZIKV和DENV均属黄病毒属成员。该属病毒结构呈二十面体球形对称，大小约为40～65 nm。病毒包含一个直径约 25～30 nm的核衣壳，以及由宿主细胞膜介导的脂质双分子层包膜，包膜嵌合有病毒包膜蛋白(Envelop，E)和膜蛋白(Membrane，M)。病毒的基因组为大小约为11 kb不分节段的单股正链RNA，基因组RNA的5′末端有1个甲基化帽状结构用于细胞翻译，3′末端为多聚腺苷酸。病毒基因组RNA可作为mRNA翻译产生单个长链多聚蛋白(5′-C-prM-E-NS1-NS2A-NS2B-NS3-NS4A-NS4B-NS5-3′)，多聚蛋白可被宿主细胞蛋白酶和病毒蛋白酶裂解为衣壳蛋白(Capsid, C),膜前体蛋白(pre-membrane, preM), 包膜蛋白(Envelop，E), 和7个非结构蛋白(Non-structure, NS)[13]。

黄病毒属成员以蜱或蚊虫作为传播媒介，主要有黄热病毒(YFV)、西尼罗病毒(WNV)、裂谷热病毒(MVEV)、日本脑炎病毒(JEV)、蜱传脑炎病毒(TBEV)、DENV、ZIKV等，多为致人疾病或地区性流行的病毒。

除了同为伊蚊虫媒传播病毒外，ZIKV在遗传进化上与DENV也很接近(见图1)。在本次美洲ZIKV高流行区，从血清学上区分ZIKV或是DENV的感染是比较难的，主要在与这两种病毒感染后血清学呈现严重的交叉反应。

ZIKV和DENV两种病毒表面均有E蛋白，其主要介导病毒与细胞的吸附、融合，可诱导宿主产生中和抗体。研究表明，ZIKV与DENV的E蛋白存在高度相似性，登革热病毒4 种血清型间的E蛋白氨基酸序列差异约为30%～35%，而与ZIKV的差异依次为41%～64%。E蛋白主要由3个结构域(Domain)，即ED I～III组成。ED I功能表现在病毒侵入时膜蛋白构象发生变化，ED II含有融合环，ED III功能是使病毒结合到细胞受体上。ZIKV的ED I、II、III对应于DENV的ED I、II、III分别有35%，51%和29%的氨基酸同源性。根据ZIKV E蛋白二聚体构象及抗原性分析，其与DENV发生交叉反应的部分主要在ED II和毗邻区域。而对ED III区来说，约有90%(27/30)ED III单抗是互为特异的[2]，因此，E蛋白的ED III区相对是特异的。

枝上所列为各病毒代表株名，其前面为其全基因组序列的登录号(GenBank asession number)，以基孔肯亚病毒为外群(out-group)。图1 部分人感染黄病毒代表株的遗传进化图Fig.1 Genomic-based phylogenetic tree of partial representative Flaviviridae viruses causing human infection. The accession number of sequence deposited in GenBank is prior to the viral designation and the Chikungunya virus is indicated as out-group.

除E蛋白外，另一与病毒的免疫侵入、致病性、血清学早期检测和ADE有关且研究较为广泛的蛋白为病毒非结构蛋白NS1。ZIKV与DENV等黄病毒基因组编码了7个非结构蛋白，已知NS3 和 NS5 具有基因组复制和蛋白加工的催化作用；NS2A、NS2B、NS4A和 NS4B是短的转膜蛋白，其主要功能在于锚定NS3 和 NS5到细胞质内质网膜边的囊泡上[2]。ZIKA的NS1有附着在细胞内膜上的二聚体和由感染的细胞分泌的六聚体，其 NS1的结构与DENV基本一致，但ZIKV NS1的静电电荷与DENV不一致，DENV NS1为阳电荷，ZIKV NS1则为阴电荷[18]，且ZIKV表现单一的嗜神经特征。抗体交叉反应引发的抗体依赖感染增强作用在黄病毒属某些成员中普便存在，但主要是E蛋白而不是NS1蛋白，前者主起中和反应，抗体交叉反应也由其引发；后者主要功能在病毒复制方面[19-20]。

4 ZIKV和DENV相继感染诱发抗体依赖增强作用

DENV异型感染可引发ADE并可导致严重临床症状的发生。而ZIKV在2015年5月才开始在美洲特别是巴西大范围流行。曾感染过DENV，再感染ZIKV是否加重寨卡病毒病，反之亦然。因此在B和T细胞水平上剖析两者间免疫交叉反应及其水平显然很重要。

Stettler等[5]从4个近期感染ZIKV恢复期患者(称ZIKV供体)采集的B细胞与鼻咽癌细胞株融合制备了119株人型单抗进行此项研究。在这4个恢复期患者中，2个未感染过DENV(ZIKV-A和-D)；另2个曾感染过DENV(ZIKV-B和-C)。根据其结合ZIKV NS1或E蛋白以及它们能够中和ZIKV感染的能力来比较分析它们的特征。同时，与另一组感染DENV恢复期患者(称DENV供体)制备的单抗进行比对分析。所有这些单抗均产生IgG抗体，强调这个抗体的种类，主要是它们可结合Fc受体，从而进行ADE发生的分析。

在119个ZIKV单抗中，41个可结合ZIKV NS1，其中部分可与DENV的NS1产生交叉反应；其中，从既往未感染DENV的供体(ZIKV-A，-D)中获得的单抗，与DENV的交叉反应要明显少于从既往曾感染过DENV的供体(ZIKV-B，-C)。而从DENV感染者中获的NS1反应性单抗，除1株外，与ZIKV无交叉反应性，但普遍存在DENV型间的交叉反应。尽管DENV和ZIKV的NS1蛋白存在51%～53%的氨基酸同源性，但两者诱导产生的单抗多具有特异性特征。此外，供体的CD4+记忆性T细胞分析表明ZIKV的NS1蛋白是特异的，与DENV只存在较低水平的交叉反应。上述特征提示NS1抗体可应用于检测试剂的开发[21]。

在E蛋白的单抗中，从ZIKV供体获得的单抗株中有65%(24/37)与DENV的E蛋白起交叉反应，而来自DENV供体的单抗株中亦有67%(31/46)与ZIKV的E蛋白有交叉反应。在上述交叉反应性单抗中，绝大部分识别ED I和II结构域，仅有少数单抗识别病毒ED III结构域。这些分析表明，E蛋白尤其是ED I/II 的血清抗体在ZIKV和DENV中存在较为严重的交叉反应。相反，不管是来自于ZIKV感染或是DENV感染的供体单抗，约有90%(27/30)ED III单抗是互为特异的，E蛋白的ED III区相对是特异的。此外，研究还发现供体中还包含一类具有病毒中和活性的非E蛋白结合单抗(Neutralizing non-E binding，NNB)。

为进一步了解ZIKV和DENV抗体的生物学特征，该研究选择一组ZIKV单抗平行进行结合、中和以及ADE激活的研究。该组单抗同时含有FcγR和补体结合的抗体，以及对应的LALA突变抗体(LALA突变是指分别在抗体分子234和235位点氨基酸发生亮氨酸(L)到丙氨酸(A)的替换突变，该突变可导致抗体无法结合FcγR)。结果表明，ED III特异性单抗具有较高的中和活性，尽管可增强ZIKV对非容许人白血病细胞系K562细胞的感染，但在高浓度(1μg/mL)条件下，ED III特异性单抗的ADE效应可被抑制；相反，ED I/II特异性单抗仅具有部分中和活性，但却能有效增强ZIKV对K562细胞的感染，诱导ADE效应。NNB单抗同样可诱导ADE效应。

用上述4份ZIKV感染者恢复期血清来分析ADE作用，结果表明，ZIKA ED III特异的LALA型单抗ZKA64能完全阻断ZIKV的ADE发生，而用DENV ED I/II特异的LALA型单抗DV82株单抗可以完全阻断DENV1型的ADE，但只能部分阻断ZIKV的ADE。 进一步地，预先注射非LALA型的ED I/II交叉反应性单抗ZIKV (ZKA78) 或 DENV(DV82)，均能够增加DENV2对AG129小鼠的致死性感染，表明ZIKA免疫后很容易增强DENV感染的致病力。尽管没有观察到交叉反应性单抗DV82增强ZIKA对免疫缺陷小鼠的感染以及致病力现象，但由于病毒感染后普遍存在交叉反应性抗体，因此，上述结果表明ZIKV和DENV异源感染使宿主ADE的发生完全是可能的。

5 结 语

据泛美卫生组织和世界卫生组织(PAHO/ WHO)2016年12月30日公报称，2016年ZIKV在美洲和其他地区迅速传播，截年末，美洲共报告超50万例ZIKV感染病例(包括疑似和确诊病例)。寨卡疫情已从突发公共卫生事件转变为长期公共卫生挑战。寨卡疫情与登革热疫情密切相关，如南美最大的国家巴西寨卡疫情严重，到2016年7月份小头症病例报告就达2500多例；不仅如此，由于寨卡疫情缘故，其奥运会的主办权曾一度受到质疑；就登革热疫情来说，截2016年8月26日，巴西52周的流行病监测报告可疑病例为1 649 008例，报告确诊病例500 972例，严重病例1 569例，死亡863人，其严重病例占确诊病例约0.3%，死亡病例则占严重病例的一半以上，虽然巴西登革热严重病例比例较低，但巴西4种血清型DENV均常年流行[22]，不能完全排除其异源感染导致的严重病例和死亡发生。

新加坡已发现寨卡病例的感染和流行[7]，泰国、菲律宾、越南、日本和中国等东南亚国家都已有输入性寨卡病例的报道，因此2017年及其后发生ZIKV流行的机率大；我国广东、福建、浙江和海南等省毗邻东南亚，时有输入性登革热并引发本土登革热流行事件的发生，因此防范ZIKV和DENV流行并从临床上加强对ADE发生的应对应是这些省份每年的重点任务[23]。

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Relationship of severe diseases that induced by cross-reactivity antibodies elicited by infection of Zika virus and Dengue virus

YAN Yan-sheng1,2,3，WENG Yu-wei1,3

(1.FujianCenterforDiseasecontrolandPrevention,Fuzhou350001China; 2.PublicHealthSchoolofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350004China；3.FujianProvincialKeyLaboratoryofZoonoses,Fuzhou350001China)

Severe infectious diseases, i.e. antibody-dependent enhancement (ADE) resulted from successive infection with different serotypes of dengue virus. After its introduction into Brazil in 2015, Zika virus has spread rapidly to more than 60 countries and regions by the end of November 2016. Some south-east Asian countries including China have also reported cases of ZIKV infection. In recent studies, it was observed that sera cross-reactivity antibodies or such monoclonal antibodies have been elicited by two domains,ED1 and ED2,of envelope (E) protein on Zika or/and Degue virus, and ADE was easily induced by such antibodies. Dengue fever epidemic often occurred in Chinese coastal provinces each year.Then,it will be followed by Zika virus disease. Therefore, we must pay attention to and propose replying measurement for it.

dengue virus;zika virus;cross reaction;exacerbation of disease

10.3969/j.issn.1002-2694.2017.02.001

国家高技术研究发展计划(No.2011AA02A114)资助

1.福建省疾病预防控制中心，福州 350001； 2.福建医科大学公共卫生学院，福州 350001； 3.福建省人兽共患病重点实验室，福州 350001

R373.3

A

1002-2694(2017)02-0093-05

2016-11-26 编辑：李友松