钠氢交换蛋白1抑制剂对严重烧伤后多脏器损伤大鼠的保护作用研究

李文鹏，赵高炀，杨薛康，马 腾

·基础医学·

·论著·

钠氢交换蛋白1抑制剂对严重烧伤后多脏器损伤大鼠的保护作用研究

李文鹏，赵高炀，杨薛康，马 腾

目的探讨钠氢交换蛋白1(NHE1)抑制剂对严重烧伤后全身多脏器功能损伤大鼠的保护作用，并探讨其潜在的机制。方法常规方法建立30%体表面积烫伤的大鼠模型。用NHE1抑制剂(卡立泊来德)干预后，通过观察组织病理学及炎症因子的改变来探讨NHE1在烧伤后多脏器损伤时所起的作用。结果NHE1在烧伤后大量表达，而NHE1的抑制剂可显著减轻烧伤后心脏、肺脏、肾脏及小肠的损伤。同时NHE1抑制剂也可以降低肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、髓过氧化物酶(MPO)水平。结论NHE1抑制剂显著减轻烧伤后大鼠多脏器损伤，其部分机制可能是抑制了组织的炎症反应。

烧伤；多脏器损伤；钠氢交换蛋白1；炎症；大鼠

烧伤是一种常见的损伤，严重烧伤可引发一系列炎症反应，从而导致多脏器功能损伤死亡率增高[1-2]。因此，有效地减轻组织炎症反应，是治疗烧伤后多脏器功能损伤、降低烧伤后致死率的主要策略。钠氢交换蛋白1(Na+/H-exchanger 1, NHE1)是一种跨膜蛋白，广泛存在于所有真核细胞表面，在机体多种脏器的缺血再灌注损伤中发挥了关键作用[3-5]。近年来，有大量研究表明NHE1可调控中性粒细胞、单核巨噬细胞和T 细胞，进而介导组织炎症反应，对NHE1的抑制可显著减少促炎因子释放，减轻组织炎症反应[4-8]。但对NHE1的抑制是否可降低烧伤后炎症反应，从而减轻烧伤后多脏器功能损伤，目前还不明确。在本实验中，笔者通过大鼠烫伤模型，观察NHE1在烧伤后多脏器功能损伤中起的作用，并初步探讨其可能的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康无特殊病原体级雄性SD大鼠70只，体质量200～250 g，由第四军医大学实验动物中心提供，所有实验操作经第四军医大学实验动物伦理委员会批准。试剂：NHE1特异性抑制剂(卡立泊来德)为德国Hoechst公司产品，牛血清白蛋白、三羟甲基氨基甲烷、氯仿、甲醇、蔗糖、抗坏血酸、硫酸亚铁和四氯化碳等实验室常规试剂均为国产AR 试剂。

1.2 动物准备 大鼠麻醉后脱毛，左侧颈动脉置管测量动脉血压、左心室收缩压(LVSP )和左心室收缩压下降水平(LV+dP/dtmax )并进行记录。完成上述步骤后将大鼠用随机数字表法分成3组：对照组、烫伤组和治疗组，每组10 只。将烫伤组与治疗组大鼠放入特制的容器中，于100 ℃水中水浴12 s，造成30% TBSA Ⅲ度烫伤(通过病理切片证实)，根据补液公式补液并镇痛。对照组于25 ℃水中水浴12 s，其余操作均与烫伤组相同。治疗组给予NHE1抑制剂(5 mg/kg )。24 h后处死各组大鼠。

表1 烫伤大鼠NHE1抑制剂处理后心功能相关指标的变化(x±s)

注：与对照组相比aP<0.01；与烫伤组相比bP<0.01。LVSP为左心室收缩压，LV+dp/dtmax为左心室收缩压下降水平，LDH为乳酸脱氧酶，CK为肌酸激酶，CK-MB为肌酸激酶同工酶，NHE1为钠氢交换蛋白1。1 mmHg=0.133 kPa

1.3 指标测定 心肌损伤和肾脏指标：包括血清乳酸脱氢酶(LDH )、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、血肌酐(Cr)和血尿素氮(BUN)应用全自动生化分析仪(Olympus)检测。炎症指标：包括肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、髓过氧化物酶(MPO )水平，采用酶联免疫试剂盒测定，同时结合分光光度计法测定。组织学损伤采用病理切片结合苏木精染色观察。

1.4 统计学处理 每个实验重复3次，所有数据以均值±标准差(x±s)表示，组间比较采用t检验，数据分析均采用SPSS 11.0软件，P<0.01为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 NHE1抑制剂可有效抑制NHE1的表达 与对照组相比，烫伤组大鼠血清NHE1mRNA表达水平有显著升高，差异有统计学意义(P<0.01 )，提示烫伤后NHE1表达活化；与烫伤组相比，治疗组血清NHE1mRNA 表达水平明显下降，差异有统计学意义(P<0.01 )，提示NHE1抑制剂有效抑制了NHE1的表达。见图1。

注：与对照组相比aP<0.01；与烫伤组相比bP<0.01

2.2 NHE1抑制剂可有效减轻烧伤后心脏损伤 与对照组相比，烫伤组大鼠LVSP和LV+dP/dtmax显著降低，差异有统计学意义(P<0.01 )；治疗组大鼠LVSP 和LV+dP/dtmax 则显著高于烫伤组，差异有统计学意义(P<0.01 )。与对照组相比，烫伤组大鼠心肌酶LDH 、CK和CK-MB显著升高，差异有统计学意义(P<0.01 )；治疗组大鼠上述指标较烫伤组显著降低，差异有统计学意义(P<0.01 )。见表1。

2.3 NHE1抑制剂可有效减轻烧伤后肺损伤 与对照组(图2A)相比，烫伤组(图2B)肺组织中可见明显的炎症细胞浸润，组织间隙明显水肿，并可见红细胞的渗出；而以上病理特征在治疗组(图2C)中可见到显著的改善。见图2。

注：A：对照组大鼠肺组织无明显异常；B：烫伤组大鼠肺组织大量炎症细胞浸润，组织间隙水肿，可见大量红细胞渗出；C：治疗组大鼠肺组织炎症细胞减少，组织间隙水肿减轻，少量红细胞渗出。NHE1为钠氢交换蛋白1

2.4 NHE1抑制剂可有效减轻烧伤后肠道损伤 与对照组(图3A)比较，烫伤组(图3B)大鼠肠黏膜可见大量炎性细胞渗出，黏膜溃疡以及黏膜坏死。而治疗组(图3C)的病理情况可见显著改善。见图3。

注：A：对照组大鼠肠组织无明显异常；B：烫伤组大鼠肠组织大量炎症细胞浸润，可见黏膜溃疡以及黏膜坏死；C：治疗组大鼠肠组织炎症细胞减少，散在小溃疡，无明显黏膜坏死。NHE1为钠氢交换蛋白1

2.5 NHE1抑制剂减轻了烧伤后肾脏损伤 与对照组相比，烫伤组BUN 和Cr 水平显著升高，差异有统计学意义(P<0.01 )；而治疗组BUN 和Cr 水平则显著低于烫伤组，差异有统计学意义(P<0.01 )。见表2。在组织病理方面(图3)，与对照组(图3A)相比，烫伤组(图3B)肾小管中出现许多管型，并有肾小球肿胀和血管充血的改变。而治疗组(图3C)的病理损伤均有所改善。

表2 烫伤大鼠NHE1抑制剂处理后血肌酐、BUN 含量及肾脏微血管通透性的变化(x±s)

注：与对照组相比aP<0.01；与烫伤组相比bP<0.01。BUN为血尿素氮，Cr为血肌酐，NHE1为钠氢交换蛋白1

注：A：对照组大鼠肾组织无明显异常；B：烫伤组大鼠肾小管中出现许多管型，并有肾小球肿胀和血管充血的改变；C：治疗组大鼠肾小管中管型减少，肾小球肿胀和血管充血减轻。NHE1为钠氢交换蛋白1

2.6 NHE1抑制剂减轻了全身炎症反应 与对照组相比，烫伤组大鼠血清中IL-6 、TNF-α、MPO 的水平明显增高，差异有统计学意义(P<0.01 )，说明烫伤后炎症反应加重。而治疗组大鼠上述炎症因子水平则低于烫伤组，差异有统计学意义(P<0.01 )，说明NHE1抑制剂减轻了炎症反应。见表3。

表3 烫伤大鼠NHE1抑制剂处理后血清中炎性因子的变化(x±s)

注：与对照组相比aP<0.01；与烫伤组相比bP<0.01。TNF为肿瘤坏死因子，IL为白细胞介素，MPO为髓过氧化物酶

3 讨论

本实验发现NHE1抑制剂显著减轻了严重烧伤后多脏器功能损伤，并对其机制进行了初步探讨。

NHE1是一种跨膜蛋白，广泛存在于所有真核细胞表面，参与介导细胞的增殖、分化、凋亡等多种功能，在组织缺血再灌注损伤过程中发挥着关键作用[3]。近年来发现NHE1在机体炎症反应中发挥着核心作用，可以介导多种炎症细胞的活化与凋亡，NHE1与炎症的关系是目前研究的热点[9-10]。越来越多的研究显示，在创伤性休克模型中，通过对NHE1的抑制可显著降低促炎细胞因子的释放，减轻机体炎症反应，进而对心脏、肺脏、肝脏和肾脏发挥保护作用[4-8]。

严重烧伤后多脏器损伤的机制非常复杂，以往的研究认为组织的缺血再灌注损伤是主要原因，但随后的多项研究均表明，即使患者早期进行了良好的液体复苏，各脏器的损伤仍不可避免[2]。近年来，越来越多的证据认为烧伤后中性粒细胞的大量活化可导致爆发性的炎症反应，是多脏器功能损伤的关键因素，通过阻断炎症反应的发生可保护受损脏器，但烧伤后炎症反应的分子机制仍不明确，临床也缺乏相应的干预措施[1-3]。

在本实验中，对NHE1的抑制显著升高了LVSP和LV+dP/dtmax值，降低了心肌酶(LDH、CK、 CK-MB)水平，提示NHE1抑制剂减轻了烧伤后心肌损伤；对NHE1的抑制还显著降低了BUN和Cr水平，减轻了烧伤诱导的病理学改变，提示通过对NHE1的抑制减轻了肺脏、肾脏和肠道的损伤，这与以往学者在其他模型中得出的结论是一致的，这也提示了NHE1可能作为有效的干预靶点，进而预防或治疗烧伤后多脏器损伤。随后的实验还发现，对NHE1的抑制显著降低了促炎细胞因子IL-6和TNF-α的表达，以及中性粒细胞活化程度(表现为MPO水平的降低)，提示对NHE1的抑制通过阻断中性粒细胞活化，进而减轻机体炎症反应。然而，NHE1抑制剂是通过哪种机制阻断了中性粒细胞的活化，目前报道较少，本实验也未能阐明，在随后的研究中我们将着重研究。

此外，NHE1介导多器官损伤的机制十分复杂。既往研究还表明，NHE1的活化可导致细胞内钠离子浓度升高，激活钠钙交换，从而导致细胞胞内钙超载，激活凋亡通路，导致组织损伤[11-12]。而钙离子介导的细胞凋亡是烧伤后多个脏器损伤的重要机制之一，提示NHE1抑制剂也可能通过调控钙离子介导烧伤后组织损伤。本实验仅明确了NHE1抑制剂对烧伤后多脏器损伤的治疗作用，初步探讨了其可能的炎性机制，进一步的研究仍在进行中。

总之，本研究发现NHE1特异性抑制剂可以降低烧伤后促炎因子释放，减轻机体炎症反应，进而保护受损脏器。NHE1可能是介导严重烧伤后炎症反应综合征及多脏器功能损伤的关键信号靶点，具有重要的研究价值。

[1] Fitzwater J, Purdue GF, Hunt JL, et al. The risk factor sand time course of sepsis and organ dysfunction after burn trauma[J]. J Trauma, 2003,54(7):959-967.

[2] Bloemsma GC, Dokter J, Boxma H, et al. Mortality and causes of death in a burn centre[J]. Burns, 2008,34(6):1103-1110.

[3] Fliegel L. The Na+/H- exchanger isoform 1[J]. Int J Biochem Cell Biol, 2005,37(11):33-37.

[4] Wu D, Dai H, Arias J, et al. Low-volume resuscitation from traumatic hemorrhagic shock with Na+/H-exchanger inhibitor[J]. Crit Care Med, 2009,37(10):1994-1998.

[5] Wu D, Arias J, Bassuk J, et al. Na+/H-exchange inhibition delays the onset of hypovolemic circulatory shock in pigs[J].Shock, 2008,29(6):519-525.

[6] Wu D, Bassuk J, Arias J, et al. Cardiovascular effects of Na+/H-exchanger inhibition with BIIB513 following hypovolemic circulatory shock[J]. Shock, 2005,23(6):269-275.

[7] Wu D, Qi J, Dai H, et al. Resuscitation with Na+/H-exchanger inhibitor in traumatic haemorrhagic shock: cardiopulmonary performance, oxygen transport and tissue inflammation[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010,37(6):337-346.

[8] Wu D, Qi J. Mechanisms of the beneficial effect of NHE1inhibitor in traumatic hemorrhage: inhibition of inflammatory pathways[J]. Resuscitation, 2012,83(6):774-779.

[9] De Vito P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity[J]. Cell Immunol, 2006,240(1):69-77.

[10] Shi Y, Kim D, Caldwell M, et al. The role of Na+/H-exchanger isoform 1 in inflammatory responses: maintaining H(t) homeostasis of immune cells[J]. Adv Exp Med Biol, 2013,961(5):411-417.

[11] Masereel B, Pochet L, Laeckmann D. An overview of inhibitors of Na+/H-exchanger[J]. Eur J Med Chem, 2003,38(8):547-555.

[12] Karmazyn M, Moffat MP. Role of Nat/Ht exchange in cardiac physiology and pathophysiology: mediation of myocardial reperfusion injury by the pH para-dox[J]. Cardiovasc Res, 1993,27(10):915-921.

(本文编辑：甘辉亮)

Inhibition of Na+/H-exchanger 1 alleviates burn-induced multiple organ injury in rats

LiWenpeng,ZhaoGaoyang,YangXuekang,MaTeng

(TheFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an710032,China)

Objective Severe burns initiate inflammatory response characterized by the upregulation of proinflammatory cytokine, which contributes to multiple organ injury. Na+/H-exchanger 1 (NHE1) plays a significant role in several inflammatory processes. This study was designed to investigate the role of NHE1in burn-induced inflammation and multiple organ injury.Methods Rats were subjected to a 30% total body surface area full-thickness burn. Cariporide was used to assess the function of NHE1in burn-induced multiple organ injury by biochemical parameters, histologic changes, and inflammatory cytokine production.Results We found that NHE1expression was significantly increased after burn injury. Inhibition of NHE1by cariporide attenuated burn-induced edema and tissue injury in heart, lung, kidney, and small intestine. Cariporide also inhibited plasma levels of tumor necrosis factor alpha (TNF-α), interleukin 6 (IL-6), and myeloperoxidase activity (MPO).Conclusion These results indicate that NHE1inhibition prevents burn-induced multiple organ injury. The salutary effects afforded by NHE1inhibition, at least in part, are mediated by attenuating systemic inflammatory response.

Burns; Multiple organ injury; Na+/H-exchanger 1; Inflammation； Rats

国家自然科学基金资助项目(81201463)

710032 西安，第四军医大学西京医院烧伤与皮肤外科(李文鹏、赵高炀、杨薛康)；第四军医大学科研部(马腾)

马腾，电子信箱：mateng@fmmu.edu.cn

R542.2

A

10.3969/j.issn.1009-0754.2017.01.006

2016-03-28)