高效液相色谱-四极杆/线性离子阱质谱测定替米沙坦中N-甲基邻苯二胺残留量

周长朋，王东武，许 洁，郑文凤，梁晓艳

(迪沙药业集团国家认定企业技术中心，山东 威海 264205)

高效液相色谱-四极杆/线性离子阱质谱测定替米沙坦中N-甲基邻苯二胺残留量

周长朋*，王东武，许 洁，郑文凤，梁晓艳

(迪沙药业集团国家认定企业技术中心，山东 威海 264205)

建立了高效液相色谱-四极杆/线性离子阱质谱(HPLC-QTRAP-MS/MS)测定替米沙坦中N-甲基邻苯二胺残留量的分析方法。替米沙坦药物以水-乙腈(80∶20，体积比)溶解后，采用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)进行分离，以0.1%(体积分数)甲酸水和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，电喷雾正离子(ESI+)扫描方式下选择离子监测(SRM)模式对样品进行检测。结果表明，N-甲基邻苯二胺在2.0～50 μg/L 范围内线性关系良好(r>0.99)，检出限(S/N=3)为0.5 μg/L ，定量下限(S/N=10)为2.0 μg/L。该方法操作简单、灵敏度高、重现性好，可用于替米沙坦中N-甲基邻苯二胺残留量的测定。

高效液相色谱-四极杆/线性离子阱质谱仪；N-甲基邻苯二胺；替米沙坦

替米沙坦(Telmisartan)是一种特异性血管紧张素Ⅱ受体(AT1型)拮抗剂，其化学名为4-{[2-正丙基-4-甲基-6-(1-甲基苯并咪唑-2-基)苯并咪唑-1-基]甲基}联苯基-2-羧酸(合成路线见图1)，具有激动过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)及显著改善血管内皮功能的作用，且能抑制血管平滑肌(VSMC)收缩和增殖，是目前较为常用的抗高血压药物[1-3]。

N-甲基邻苯二胺是替米沙坦合成的起始物料，具有1个苯胺结构，且有一定的致癌毒性，依照欧洲基因毒性杂质的指导原则其应属于潜在基因毒性杂质[4]，必须进行严密的控制。参照欧洲EMEA提出的采用“毒理学关注阈值”(Threshold of toxicological concern，TTC)作为基因毒性杂质可接受限度的计算方法[5]，N-甲基邻苯二胺的限度为5.0 mg/L，若以替米沙坦的配制浓度为1.0 mg/mL计算，则实际检测浓度应为5.0 μg/L，对检测水平的要求较高。目前针对邻苯二胺的检测方法主要有气相色谱法[6]、液相色谱法[7]、荧光光谱滴定法[8]、化学发光法[9]等，上述方法的检出限均较高。而对于药物中基因毒杂质N-甲基邻苯二胺的研究相对较少，其中王金朝等[10]利用液相色谱法检测了替米沙坦中的N-甲基邻苯二胺残留，但其检出限为40 ng/mL，难以满足当前的限度要求。而国外已有多篇文献报道利用液相色谱-质谱联用仪检测药物中基因毒杂质[11-12]，国内也有利用气质联用仪[13-14]、液质联用仪[15-16]等监控基因毒性杂质的方法报道，但对于N-甲基邻苯二胺的液质联用检测方法尚未见报道。

图1 替米沙坦的合成路线图Fig.1 Graphical synthetic routes of telmisartan

四极杆-线性离子阱(QTRAP-MS/MS)质谱仪是一种混合型串联质谱，具有与传统三重四极杆质谱仪相当的定量功能，且灵敏度和特异性均较高，现已广泛应用于食品、药品、环境等领域[17-22]。本文基于高效液相色谱-四极杆/线性离子阱质谱(HPLC-QTRAP-MS/MS)技术，建立了测定替米沙坦药物中基因毒性杂质N-甲基邻苯二胺的分析方法。该方法操作简单、回收率好、灵敏度高，填补了国内替米沙坦药物N-甲基邻苯二胺定量检测研究的空白，有利于对替米沙坦药物合成过程中的质量参数进行有效监测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Thermo LTQ-XL型高效液相色谱-四极杆/离子阱质谱仪：配有电喷雾离子源；超声波清洗机(昆山超声仪器公司)；BT-25S精密分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司 )；Milli-Q超纯水仪(美国Millipore公司)；0.22 μm有机系滤膜(天津市津腾实验设备有限公司)。

N-甲基邻苯二胺盐酸盐(纯度≥99%，购自Sigma-Aldrich公司)；乙腈(色谱纯，德国Merck公司)；甲酸(优级纯，天津大茂化学试剂厂)；实验用水为Milli-Q超纯水(电阻率为18.2 MΩ·m)；替米沙坦精品(迪沙药业集团有限公司)。

1.2 溶液的制备

对照品溶液：取N-甲基邻苯二胺盐酸盐适量，精密称定，至10 mL容量瓶中，加少量乙腈超声溶解，用乙腈定容至刻度，配制成含N-甲基邻苯二胺1.0 g/L的标准储备液，于-18 ℃避光保存。取适量标准储备液，用乙腈配制成10.0 mg/L的标准中间液，作为对照品溶液，于4 ℃避光保存。上机前用水-乙腈(体积比80∶20)稀释成相应浓度，过0.22 μm滤膜后注入质谱。

供试品溶液：取替米沙坦精品约10 mg，精密称定，至10 mL容量瓶中，加少量乙腈超声溶解后，再加入水-乙腈(80∶20)定容至刻度，过0.22 μm滤膜后注入质谱。

1.3 色谱条件

Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)；流动相：A为0.1%(体积分数)甲酸水溶液，B为乙腈；流速：0.2 mL/min；梯度洗脱程序：0～ 2.00 min，20% B；2.00～4.00 min，20%～95% B；4.00～9.00 min，95% B；9.01～15.00 min，20% B；柱温35 ℃；进样体积为10 μL。

1.4 质谱条件

离子源：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；检测方式：选择离子检测(SRM)；离子源温度：320 ℃；辅助气温度：300 ℃；鞘气：35 L/min；辅助气：15 L/min；毛细管电压：3 500 V；定量方式：外标法定量；定量离子对：m/z123.1/107.6，碰撞能量(CE)：35 V。

图2 N-甲基邻苯二胺(5.0 μg/L)在不同配制溶液中的降解曲线Fig.2 Degradation curve of N-methyl-o-phenylenediaie(5.0 μg/L)in different solution

2 结果与讨论

2.1 配制溶液的选择

N-甲基邻苯二胺含有1个氨基，溶解后呈弱碱性，在酸性环境下易发生降解。因此，本研究考察了不同配制溶液对N-甲基邻苯二胺降解速度的影响，分别采用初始流动相(0.1%甲酸水溶液-乙腈，80∶20)、水、乙腈和水-乙腈(80∶20)配制浓度为5.0 μg/L的N-甲基邻苯二胺对照品溶液，放置0，0.1，0.2，0.5，1，2，4 h后上机检测，发现N-甲基邻苯二胺在0.1%甲酸水溶液-乙腈中的降解速度较快，降解幅度较大，而在水、乙腈和水-乙腈(80∶20)中的降解速度较慢，降解幅度较小(见图2)。进一步研究发现，替米沙坦在水中的溶解度非常差，不利于供试品溶液的配制；乙腈对替米沙坦的溶解性虽较好，但配制后N-甲基邻苯二胺和替米沙坦主峰的峰形均不好，而采用水-乙腈溶液(80∶20)配制后的峰形较好，替米沙坦的溶解度也较好，保证了样品与对照品配制溶液的一致性，故本文选用水-乙腈溶液(80∶20)作为N-甲基邻苯二胺标准溶液和替米沙坦供试液的配制溶液。

2.2 色谱条件的选择

N-甲基邻苯二胺的极性非常大，出峰时间较早，而替米沙坦的极性偏小，出峰相对较晚，二者的分离难度不大，且N-甲基邻苯二胺在主峰之前出峰，基本不受替米沙坦的干扰影响。本文在相近的色谱条件下，考察了Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱(3.5 μm，2.1 mm×100 mm)、Thermo Hypersil-C18色谱柱(1.9 μm，2.1 mm×100 mm)和Agilent Extend-C18(1.8 μm，2.1 mm×50 mm) 3种色谱柱的分离情况。结果显示，上述3种色谱柱均能实现替米沙坦主峰和N-甲基邻苯二胺的有效分离，且N-甲基邻苯二胺的质谱峰形也较好。但考虑到Thermo Hypersil-C18和Agilent Extend-C18色谱柱的柱容量均较小，检测的进样量为10 μL，多次进样后易残留替米沙坦，影响检测结果。而Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱的内径为3.5 μm，柱容量较大，主峰基本不会残留，故本文选用Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱进行分离。

图3 N-甲基邻苯二胺标准的SRM色谱图Fig.3 SRM chromatogram of N-methyl-o-phenylenediamine

2.3 质谱条件的选择

采用电喷雾离子源，在正离子模式下，对1.0 mg/L的N-甲基邻苯二胺标准溶液进行母离子全扫描，确定其分子离子[M+H]+峰(m/z123.1)；对分子离子峰进行碎裂并扫描子离子，得到二级质谱图，筛选响应值较高、基线噪音低的离子(m/z107.6)作为监测离子。采用选择反应检测(SRM)模式采集数据，驻留时间设定在100 ms，优化各离子的碰撞能，得到最佳质谱条件如“1.4”所述。在优化条件下，得N-甲基邻苯二胺标准的SRM色谱图(图3)。

2.4 方法的线性范围、检出限及定量下限

以水-乙腈(80∶20)配制0.0，2.0，5.0，10，20，50 μg/L的N-甲基邻苯二胺标准系列溶液分别进行测定，以定量离子峰面积对质量浓度进行线性回归计算。结果表明，N-甲基邻苯二胺在0.0～50 μg/L范围内线性关系良好(r>0.99)；以质谱3倍基线噪音计算检出限(S/N=3)为0.50 μg/L，以质谱10倍基线噪音计算定量下限(S/N=10)为2.0 μg/L，完全满足依照欧盟基因毒性杂质指导原则计算的5.0 μg/L浓度的杂质限度。

2.5 回收率实验

采用不含N-甲基邻苯二胺的替米沙坦精品为空白基质，进行不同浓度的加标回收实验时发现，各加标浓度下的回收率均较低；且在精密度试验时发现，随着检测时间的延长回收率逐渐降低，可能是N-甲基邻苯二胺在替米沙坦溶液中发生了降解。研究发现，替米沙坦具有羧酸结构，其样品溶液呈弱酸性，而N-甲基邻苯二胺在酸性条件下会发生降解。进一步做降解试验发现，N-甲基邻苯二胺在替米沙坦溶液中呈明显的降解趋势，但降解的速率较慢(见表1)，不同浓度的N-甲基邻苯二胺在1 h内的降解率均不超过5%，若能在添加实验时现配现测，基本不会影响回收率效果。本文也尝试将替米沙坦溶液调节pH值至中性，回收率可得到明显改善，但操作较为繁琐，且相应的对照品溶液也需调节pH值，不利于实际操作。因此，本文采用不含N-甲基邻苯二胺的替米沙坦精品为空白基质，添加了80%限度、100%限度、120%限度浓度的N-甲基邻苯二胺分别做回收率和精密度试验，每个浓度设3个平行，且所有添加样品均在溶液配制1 h内进行检测，得到平均回收率为85.7%～94.3%，相对标准偏差(RSD)为1.9%～2.9%(见表2)，表明方法的回收率良好，完全可以满足检测要求。

表1 不同添加浓度的N-甲基邻苯二胺在替米沙坦溶液中的降解率Table 1 Degradation rate of N-methyl-o-phenylenediaine in telmisartan at different spiked levels /%

*degradation rate =(CA-CF)/CA×100%，CA：added of N-methyl-o-phenylenediaine，CF：founded of N-methyl-o-phenyl-enediaine at different time points

表2 替米沙坦中添加N-甲基邻苯二胺的回收率及相对标准偏差Table 2 Recoveries and RSDs of N-methyl-o-phenylenediamine in telmisartan

图4 替米沙坦成品中含N-甲基邻苯二胺的阳性样品色谱图(151104A2Y)Fig.4 Chromatogram of positive samples with N-methyl-o-pheny-lenediamine in telmisartan(151104A2Y)

2.6 实际应用

将所建方法应用于检测合成的药物小试3批、中试3批及工艺验证3批共27份样品，所有样品均在配制1 h内检测，共检出6批含有N-甲基邻苯二胺残留，检出结果分别为2.60 mg/kg(151216A2J)，3.21 mg/kg(151216B1J)，49.42 mg/kg(151216B1Y)，12.30 mg/kg(151104A2Y)，6.46 mg/kg(151104B2Y)，7.73 mg/kg(151104B3Y)，其中有4批样品超过限度要求，其他样品均未检出，151104A2Y阳性样品谱图见图4。

3 结 论

本文首次建立了高效液相色谱-四极杆/线性离子阱质谱测定替米沙坦药物中基因毒性杂质N-甲基邻苯二胺残留量的分析方法。该方法灵敏度高、分离度好，回收率、精密度及定量下限均能满足基因毒性杂质的限度要求，是检测替米沙坦药物中N-甲基邻苯二胺残留量的有效方法。将所建方法用于检测合成的替米沙坦药物样品，共检出6批含有N-甲基邻苯二胺残留，方法有效地指导了替米沙坦合成反应的进行，并为项目的研发过程起到了良好的监督作用。

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Determination of N-Methyl-o-phenylenediamine in Telmisartan by HPLC-QTRAP-MS/MS

ZHOU Chang-peng*，WANG Dong-wu，XU Jie，ZHENG Wen-feng，LIANG Xiao-yan

(National Enterprise Technology Center of Disha Pharmaceutical Group，Weihai 264205，China)

A high performance liquid chromatography-quadrupole ion mass spectrometric(HPLC-QTRAP-MS/MS) method was developed for the determination of N-Methyl-o-phenylenediamine residues in telmisartan.After extracted with water-acetonitrile(80∶20，by volume)，the telmisartan samples were separated on an Agilent Eclipse XDB-C18column(3.5 μm,2.1 mm×100 mm) with a mobile phase of 0.1% formic acid solution-acetonitrile.The electrospray was operated in the positive mode and the samples were monitored under the select reaction monitoring(SRM) mode.As a result，the calibration curves of N-Methyl-o-phenylenediamine showed a good linearity(r>0.99) in the range of 2.0-50 μg/L.The limits of detection(S/N=3) was 0.5 μg/L ，and the limits of quantitation(S/N=10) was 2.0 μg/L.The method has the advantages of simple operation，high sensitivity，good reproducibility，and could be used for the detection of N-Methyl-o-phenylenediamine residues in telmisartan.

high performance liquid chromatography-quadrupole ion mass spectrometry(HPLC-QTRAP-MS/MS)；N-methyl-o-phenylenediamine；telmisartan

2016-09-09；

2016-09-28

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.02.019

O657.63；TQ460.726

A

1004-4957(2017)02-0262-05

*通讯作者：周长朋，工程师，研究方向：理化检测及药物分析，Tel：0631-3857373，E-mail：20019568@qq.com