MIF基因rs755622位点多态性与广西壮族人群炎症性肠病的关系

覃立锋，吕晓丹，吕小平，黄力毅，陈兰

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

·临床研究·

MIF基因rs755622位点多态性与广西壮族人群炎症性肠病的关系

覃立锋，吕晓丹，吕小平，黄力毅，陈兰

(广西医科大学第一附属医院，南宁530021)

目的 探讨巨噬细胞移动抑制因子(MIF)基因rs755622位点多态性与广西壮族人群炎症性肠病(IBD)的关系。方法 选择广西壮族溃疡性结肠炎(UC)患者144例(UC组)、克罗恩病(CD)患者101例(CD组)，另选广西壮族健康志愿者202例(对照组)，取各组肠黏膜组织，抽提基因组DNA，采用PCR技术扩增MIF基因目的片段，并进行产物测序，结果在GenBank数据库上进行序列比对。结果 所有目的片段的测序结果与GenBank数据库上序列一致。以CC基因型为参照，UC组GG、GC基因型与对照组同基因型比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。以CC基因型为参照，CD组GG、GC基因型与对照组同基因型比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。UC组、CD组G、C等位基因频率与对照组比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。结论 MIF基因rs755622位点多态性与广西壮族人群IBD的易感性无明显相关性。

炎症性肠病；溃疡性结肠炎；克罗恩病；巨噬细胞移动抑制因子；单核苷酸多态性

炎症性肠病(IBD)是一种病因尚未明确的慢性非特异性肠道炎症性疾病，包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD)。IBD在不同国家、地区、种族间发病率不同，有明显的地域和种族差异，既往在欧洲和北美地区高发，近年来其发病率在亚洲地区呈逐渐升高趋势。IBD的病因和发病机制尚未完全明确，目前认为可能是环境等多种因素作用于遗传易感者，并在肠道菌群或尚未明确的特异性微生物参与下，启动了肠道免疫及非免疫系统，最终导致免疫反应和炎症反应过程[1]；其中遗传易感性是IBD发病的一个基础因素。巨噬细胞移动抑制因子(MIF)是一种具有多种生物活性的细胞因子，在机体的炎症反应和免疫反应中发挥重要作用。有研究发现，MIF基因(rs755622位点)与先天性关节炎、银屑病、遗传性过敏症等自身免疫性疾病的发病有关[2～4]，但其与IBD相关性研究的报道结论并不一致。广西是我国壮族人口最大的聚居地，其疾病遗传性和易感基因非常独特[5]。本研究探讨MIF基因rs755622位点多态性与广西壮族人群IBD的关系，旨在为壮族人群IBD的基因诊断及治疗提供线索。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择2013年1月～2016年2月在广西医科大学第一附属医院就诊的IBD患者245例，其中UC患者144例(UC组)、CD患者101例(CD组)。UC组男71例、女73例，年龄(39.5±15.94)岁；CD组男49例、女52例，年龄(38.9±16.14)岁。纳入标准：①在广西长期生活、近三代直系亲属均为壮族且未与其他民族通婚的广西居民；②符合《炎症性肠病诊断与治疗的共识意见(2012年·广州)》[6]。排除标准：①合并其他感染性结肠炎和非感染性结肠炎者；②合并其他自身免疫性疾病的IBD者；③相互之间有亲缘关系的IBD者。同期另选健康志愿者202例(对照组)，均为在广西长期生活、近三代直系亲属为壮族且未与其他民族通婚的广西居民，相互之间无亲缘关系，且与IBD患者无亲缘关系。其中，男99例、女103例，年龄(39.2±16.23)岁。三组性别、年龄具有可比性。本研究经广西医科大学第一附属医院伦理委员会审核批准，患者均知情同意。

1.2 MIF基因rs755622位点检测 ①标本收集：在行电子结肠镜检查过程中，钳取适量肠黏膜组织，生理盐水清洗干净，液氮罐中冻存。②基因组DNA提取：取各组肠黏膜组织30～50 mg，剪碎，液氮下研磨成粉末。采用基因组提取试剂盒抽提基因组DNA。使用微量核酸蛋白测定仪检测DNA浓度和纯度合格，-20 ℃冰箱保存。③PCR扩增：根据NCBI基因数据库设计MIF基因(包含rs755622位点)引物，由大连宝生物工程有限公司合成。上游引物：5′-GGCGACTAACATCGGTGA-3′，下游引物：5′-GCAGAAGGACCAGGAGAC-3′，目的片段长度358 bp。采用降落PCR程序扩增目的片段。PCR反应体系共20 μL：DNA 1 μL，2×Gflex PCR Buffer 10 μL，上下游引物各0.5 μL，Tks Gflex DNA polymerase 1 μL，ddH2O 7 μL。反应条件：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，3个循环；95 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，3个循环；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环；95 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，5个循环；最后72 ℃延伸7 min。取PCR产物5 μL在含核酸染料的2%琼脂糖凝胶上电泳(120 V，45 min)，紫外光分析仪鉴定目的片段。④基因测序：采用切胶纯化试剂盒将目的片段纯化回收，并将回收的目的片段送南京金斯瑞生物科技有限公司测序，测序结果在GenBank数据库上进行序列比对。

1.3 统计学方法 采用SPSS20.0统计软件。基因型分布遗传平衡采用Hardy-Weinberg遗传平衡性检验，P>0.05提示群体基因遗传平衡，样本来自同一孟德尔群体。各组间基因型频率和等位基因频率比较采用χ2检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR扩增产物电泳结果 所有PCR产物呈清晰均一条带，大小为358 bp，与目的片段大小一致。

2.2 PCR产物测序结果 通过比对，确定所有目的片段的测序结果与GenBank基因库上序列一致。rs755622位点共得到3种基因型：CC、GC和GG型。见插页Ⅱ图4。其基因型频率及等位基因频率分布见表1。UC组、CD组、对照组基因型分布均符合遗传平衡定律(P均>0.05)，具有群体代表性。以CC基因型为参照，UC组GG、GC基因型与对照组同基因型比较差异均无统计学意义(χ2分别为0.261、0.287，P均>0.05)。以CC基因型为参照，CD组GG、GC基因型与对照组同基因型比较差异均无统计学意义(χ2分别为0.311、1.645，P均>0.05)。UC组、CD组G、C等位基因频率与对照组比较差异均无统计学意义(χ2分别为0.019、0.317，P均>0.05)。

3 讨论

表1 各组MIF基因rs755622位点基因型与等位基因频率分布

IBD的发病具有明显的地域和种族差异。虽然IBD的病因和发病机制尚未完全清楚，但普遍认为是由于环境或其他多种因素作用于遗传易感者所致[7～9]。单卵双胞胎高共患率以及IBD的家族聚集性和种族差异性，表明IBD的发病亦与遗传因素密切相关。2001年Hugot等[10]报道了第一个CD易感基因NOD2/CARD15。到目前为止，人们通过全基因组关联性研究已经发现了160多个IBD易感位点。

1966年Bloom等[11]用豚鼠进行变态反应研究时发现了一种炎症因子，其具有限制巨噬细胞游走的功能，因此被命名为MIF。MIF是一种含有115个氨基酸残基的蛋白质，相对分子量为12 500，具有α链和β链组成的三维晶体结构，与其他已知蛋白质之间无明显的同源性。MIF的晶体结构是由3个同源三聚体(含2个反向平行α螺旋和6个β片层单体)形成的一个末端开放的中空结构[12]。MIF的表达具有组织特异性，主要表达于胃肠道、肺、皮肤表层、泌尿生殖道等组织[13]。MIF是一种具有限制巨噬细胞游走活性的多源性促炎细胞因子，能控制巨噬细胞在炎症部位的浸润、聚集，并促使巨噬细胞分泌多种化学物质及细胞因子，因此是人体炎症反应和免疫应答过程中关键性的细胞因子。健康个体肠道内的促炎症反应和抗炎症反应处于精密调控的平衡之中。但在IBD患者体内该平衡被打破，大量的促炎症因子高表达，导致免疫系统的过度活化，促炎症反应明显增强，而抗炎症反应被抑制。由于MIF在机体炎症反应和免疫应答过程中具有重要作用，其在IBD中的作用亦受到重视。但目前其研究结果并不一致。Ohkawara等[14]研究发现，在正常大鼠结肠上皮细胞中仅有微量MIF表达，而在葡聚糖硫酸酯钠诱导的结肠炎组织中MIF表达显著增加。张启芳等[15]研究发现，UC患者外周血和病变肠黏膜组织中MIF表达显著增加，而在CD患者外周血和病变肠黏膜组织中表达并未明显增加。

人类MIF基因定位于染色体22q11.2，长度约为0.8 kb，由3个外显子和2个内含子组成[16]。在MIF的cDNA序列中，其rs755622位点G或C的变化构成了MIF基因的多态性。该多态性位点位于MIF基因的启动子区，-173G/C多态性会影响MIF基因的转录和翻译，进而影响体内MIF水平，并决定疾病的易感性[17]。研究发现，MIF基因rs755622位点突变与青少年先天性关节炎的发病有关[2]； 有研究亦发现，MIF基因rs755622位点为炎性关节炎的易感基因[16]； MIF-173*C等位基因，特别是CATT(7)-MIF-173*C单倍体与银屑病的发病相关[3]；MIF基因rs755622位点多态性是遗传性过敏症的一个危险因素[4]；IBD患者与健康人群的MIF基因rs755622位点基因型分布和等位基因频率比较无统计学差异，但GC基因型人群可能有更高的发病趋势。Nohara等[18]在日本人群中未发现MIF基因rs755622位点多态性在UC患者与健康人群有分布差异。费保莹等[19]对浙江地区汉族人群的研究发现，UC患者MIF基因rs755622 C/C基因型频率显著高于正常人，提示CC基因型可能为其易感基因。谭诗云等[20]Meta分析发现，MIF基因rs755622位点可能是UC发病的易感基因，但与CD发病无明显相关性。

本研究UC、CD患者MIF基因rs755622位点各基因型分布和等位基因频率与健康人群比较均无统计学差异，说明MIF基因rs755622位点多态性与广西壮族人群IBD的易感性无明显相关性。与Nohara等[18]报道基本一致。本研究并未发现IBD患者基因型频率与对照组比较有统计学差异，与Mrowicki等[17]报道并不一致。其原因可能与地域和种族差异有关。

综上所述，MIF基因rs755622位点多态性可能与广西壮族人群IBD无明显相关性。但本研究的样本量偏小，且为单一种族研究，其结果的准确性有待于更大规模研究或在其他人群中进一步验证。

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国家自然科学基金资助项目(81460114)；广西医科大学青年科学基金(GXMUYSF201334)。

陈兰(E-mail： chenll2008@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.017

R574

B

1002-266X(2017)08-0056-03

2016-10-31)