低频超声联合载顺铂超声微泡造影剂对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

孙佳星，蔡爱露

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳110000)

低频超声联合载顺铂超声微泡造影剂对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响

孙佳星，蔡爱露

(中国医科大学附属盛京医院，沈阳110000)

目的 探讨低频超声联合载顺铂超声微泡造影剂对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响及机制。方法 体外培养人卵巢癌OVCAR-3细胞，随机分为对照组、超声组、顺铂组、超声联合顺铂组和超声联合顺铂微泡组。各组常规培养，顺铂组、超声联合顺铂组加入顺铂至终浓度为10 μg/mL；超声联合顺铂微泡组加入载顺铂超声微泡造影剂至顺铂终浓度为10 μg/mL；超声联合顺铂组、超声联合顺铂微泡组同时予低频超声处理3 min。超声组仅予低频超声处理3 min，对照组不予任何处理。培养24 h，采用 CCK-8法检测各组细胞增殖能力；流式细胞术检测各组细胞凋亡率；Western blotting法检测各组Bax、Bcl-2和Caspase-3的相对表达量。结果 细胞增殖能力：超声联合顺铂微泡组<超声联合顺铂组<顺铂组<超声组<对照组，组间两两比较P均<0.05。细胞凋亡率：超声联合顺铂微泡组>超声联合顺铂组>顺铂组>超声组>对照组，组间两两比较P均<0.05。Bax、Caspase-3的相对表达量：超声联合顺铂微泡组>超声联合顺铂组>顺铂组>超声组>对照组；Bcl-2的相对表达量：超声联合顺铂微泡组<超声联合顺铂组<顺铂组<超声组<对照组；组间两两比较P均<0.05。结论 低频超声联合载顺铂微泡造影剂可抑制卵巢癌细胞增殖，诱导其凋亡，其效果强于低频超声联合顺铂、单用低频超声或顺铂；其机制可能与提高细胞内Caspase-3、Bax表达，降低Bcl-2表达有关。

卵巢癌；低频超声；顺铂；超声微泡造影剂；细胞凋亡；细胞增殖

顺铂是治疗卵巢癌的常见化疗药物[1]，但其毒副反应多，且近年来耐药率逐渐升高[2]。增加卵巢癌细胞对顺铂的敏感性、提高顺铂局部浓度是目前临床研究的热点。有研究证实，低频超声(频率<1.5 MHz)可诱导肿瘤细胞凋亡[3～5]，并促进某些肿瘤相关基因的表达[6]。Korosoglou等[7]研究发现，可将化疗药物置入微泡注入人体，然后用低频超声照射肿瘤组织，微泡在低频超声“空化效应”下发生不对称的压缩和膨胀，直至破裂，释放出化疗药物，达到靶向治疗的目的。目前低频超声联合载顺铂超声微泡造影剂已用于治疗宫颈癌、肾癌等[8]。2016年1～8月，本研究探讨低频超声联合载顺铂微泡造影剂对卵巢癌细胞增殖和凋亡的影响，并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料 人卵巢癌细胞系OVACR-3购自中国科学院上海细胞生物研究所，置于含10% FBS的DMEM培养基中，37 ℃、5% CO2培养箱中培养。顺铂、载顺铂微泡和DMSO购自北京索莱宝科技有限公司；FBS和DMEM培养基购自美国Gibco公司；胰蛋白酶购自美国Sigma公司；超声波治疗仪购自深圳市圣祥高科技有限公司；CCK-8试剂盒和凋亡试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司；流式细胞仪购自美国BD公司；多功能酶标仪购自美国Molecular Devices公司；兔抗人Bax、Bcl-2、Caspase-3和GAPDH多克隆抗体购自武汉三鹰生物技术有限公司；辣根酶标记的羊抗兔IgG购自北京中衫金桥生物技术有限公司。

1.2 细胞分组及处理 取对数生长期OVACR-3细胞制成密度为1×106个/mL的单细胞悬液。实验前用DMEM溶解载顺铂超声微泡和顺铂备用。 将OVCAR-3细胞随机分为对照组、超声组、顺铂组、超声联合顺铂组和超声联合顺铂微泡组，每组3管。对照组细胞常规培养，不作任何处理。顺铂组、超声联合顺铂组加入顺铂至终浓度为10 μg/mL，超声联合顺铂微泡组加入载顺铂超声微泡造影剂至顺铂终浓度为10 μg/mL；超声联合顺铂组和超声联合顺铂微泡组同时予低频超声处理，频率840 kHz，声强0.75 W/cm2，时间3 min。超声组仅予低频超声处理。各组继续培养24 h。

1.3 相关指标观察

1.3.1 细胞增殖能力 取各组细胞置入96孔板中，每孔100 μL(含1×104个细胞)，加入10 μL CCK-8溶液，37 ℃孵育4 h。采用酶标仪测定各组450 nm 波长处的吸光度(OD)值。以OD值表示细胞增殖能力。

1.3.2 细胞凋亡率 取各组对数生长期细胞制成密度为1×106个/mL的细胞悬液。分别取100 μL细胞悬液置入5 mL离心管中，加入FITC Annexin V和PI各5 μL，混匀，避光，室温孵育15 min，每管加400 μL的1×结合液。采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率。

1.3.3 细胞内Bax、Bcl-2、Caspase-3表达 取各组细胞，RIPA裂解，超声破碎细胞，11 000 r/min离心20 min，取上清，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒检测样品蛋白浓度合格。取部分蛋白样品加入5×上样缓冲液煮沸5 min。然后行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转印至聚偏二氟乙烯膜。5%脱脂奶粉封闭1.5 h，一抗孵育，4 ℃过夜。山羊抗兔二抗孵育2 h，ECL发光，显影液显影，定影液定影。用Image J软件分析各条带灰度值。以目的蛋白条带灰度值与GAPDH蛋白条带灰度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞增殖能力比较 对照组、超声组、顺铂组、超声联合顺铂组和超声联合顺铂微泡组OD450值分别为0.931±0.053、0.752±0.032、0.632±0.042、0.553±0.036、0.423±0.023。组间两两比较P均<0.05。

2.2 各组细胞凋亡率比较 对照组、超声组、顺铂组、超声联合顺铂组和超声联合顺铂微泡组细胞凋亡率分别为(8.23±0.92)%、(10.21±1.02)%、(16.33±0.98)%、(20.54±1.33)%、(25.32±1.74)%。组间两两比较P均<0.05。

2.3 各组Bax、Bcl-2、Caspase-3表达比较 各组间Bax、Bcl-2、Caspase-3的相对表达量，两两比较P均<0.05。见表1。

3 讨论

表1 各组Bax、Bcl-2、Caspase-3的相对表达量

随着微泡造影剂研究的不断进展，超声联合微泡造影剂在肿瘤性疾病中的应用越来越受到关注。超声微泡造影剂发展经历了三个阶段，第一代为含空气或氧气的无包膜气泡，尺寸较大，不稳定，不能由外周静脉注入[9]；第二代为外围包裹一层白蛋白、脂类、聚合物或表面活性剂膜壳的空气气泡，稳定性较好且体积较小，在血液中仅持续5 min左右[10]；第三代为含氟碳类气体，外有膜包裹，在血液中可持续15 min以上，稳定性进一步提高[11]。微泡造影剂的不断革新是超声联合微泡成为肿瘤辅助化疗或靶向治疗的基础。携带化疗药物的微泡造影剂可在超声“空化效应”的介导下破裂，在靶组织区域释放药物，不仅能增加局部药物浓度，还可减轻化疗药物的毒副作用[12]；同时微泡造影剂所产生的机械能可进一步增加细胞膜的通透性，促进药物分子进入细胞内。低频超声联合微泡的治疗效果已在多种肿瘤中得到了验证。王娜等[13]研究发现，利用小于1 MHz低频超声联合紫杉醇微泡造影剂介导药物释放，可明显抑制宫颈癌HeLa细胞增殖并能诱导其凋亡。Xu等[14]研究发现，低频超声辐照辛伐他汀微泡可通过下调Caveolin-1蛋白的表达，促进前列腺癌DU145细胞凋亡，并增强DU145细胞对化疗药物的敏感性。由此可见，低频超声联合微泡造影剂在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。但其目前仍处于实验阶段，依然有较多问题亟待解决。

本研究结果显示，低频超声联合载顺铂超声微泡可抑制卵巢癌OVCAR-3细胞增殖，并诱导其凋亡，其效果强于低频超声联合顺铂及单用低频超声或顺铂。微泡造影剂是一种直径为1～8 μm，内含高密度惰性气体、外部有单层膜包裹的微气泡，具有良好的弹性和稳定性，对声压具有较强的抵抗力。研究证实，低频超声可促使微泡造影剂发生周期性的压缩和膨胀，当微泡的震荡加剧到一定程度就会破裂，即“空化效应”[15]。将低频超声联合携带某些药物或基因微泡造影剂，然后将微泡造影剂静脉注入体内，用低频超声照射特定组织，微泡在低频超声的“空化效应”下发生破裂，致使微泡所携带的药物释放到组织周围，从而增加了局部的药物浓度[16]；与此同时，低频超声导致细胞膜产生一过性空隙，促使细胞膜的通透性增加，即所谓的“声孔效应”[8]。这一效应进一步促进药物分子的摄入。通过以上两种作用，低频超声联合微泡造影剂可增加药物的靶向利用率，并能减轻其毒副反应。

本研究结果显示，单纯低频超声对卵巢癌细胞也具有促进凋亡、抑制增殖的作用。Sergeeva等[17]研究发现，频率为26.5 kHz的低频超声处理MCF-7细胞15 s，MCF-7细胞增殖率降低；杨志宏等[18]研究发现，用低频超声处理的卵巢癌COC1细胞增殖能力降低，细胞凋亡率升高。有学者认为，这可能与低频超声的“空化效应”有关。低频超声处理使细胞产生大量的自由基，并通过打断DNA双链的聚合过程，阻断肿瘤细胞正常复制，抑制肿瘤细胞增殖[19]。不仅如此，低频超声还可对细胞的结构和功能产生调节作用，如细胞膜通透性会在“声孔效应”作用下发生一过性增加，导致细胞裂解[20]。

凋亡是细胞自我程序性死亡，是由基因控制的有序性死亡。细胞凋亡途径包括内源性和外源性途径[21]。外源性凋亡途径是通过凋亡刺激因子与细胞表面相关受体结合，直接激活下游的Caspase效应分子而诱导凋亡[22]。内源性凋亡途径是由线粒体激活的细胞凋亡过程，线粒体在此过程中具有核心作用。负责监管线粒体依赖凋亡途径的是Bcl-2蛋白家族。 Bcl-2凋亡蛋白根据其结构可分为BH3-单域蛋白组和多域蛋白组[23]。BH3单域蛋白通常在胞质中无活性，当运至线粒体时，要么激活多域蛋白Bax和Bak，要么灭活Bcl-2抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL[24]。本研究结果显示，与其他各组相比，超声联合顺铂微泡组Caspase-3、Bax蛋白表达升高，Bcl-2表达下降，原因可能是超声联合顺铂微泡组卵巢癌OVCAR-3细胞凋亡率高于其余各组。

综上所述，超声联合载顺铂超声微泡造影剂可抑制卵巢癌细胞增殖，并诱导其凋亡。本研究为超声联合微泡造影剂在卵巢癌的临床治疗提供了理论依据。该方法对肿瘤的靶向治疗具有广阔的应用前景，但仍存在许多问题需要进一步研究与探索。

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蔡爱露(E-mail: caial1224@sina.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.08.013

R737.31

A

1002-266X(2017)08-0044-03

2016-09-22)

天津市应用基础及前沿技术研究计划(10JCYBJC13600)；天津医科大学科学基金青年项目(2014KYQ18)。