猪种布鲁氏菌对4种常用新型消毒剂敏感性的研究

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（1.山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600；3.邹平县畜牧兽医局山东滨州256600）

猪种布鲁氏菌对4种常用新型消毒剂敏感性的研究

董炳梅1，杨丽梅2，张含侠3，吕素芳2，李峰2*

（1.山东绿都生物科技有限公司山东滨州256600；2.山东省滨州畜牧兽医研究院山东滨州256600；3.邹平县畜牧兽医局山东滨州256600）

为了确定常用新型消毒剂对布鲁氏菌的杀菌/抑菌效果，本研究将聚维酮碘、戊二醛、戊二醛癸甲溴铵复方溶液、二氯异氰尿酸钠4种常用消毒剂与定量B.suis混合均匀，分别作用3 min、10 min与30 min，取0.1 mL涂布于TSA培养基中进行菌落计数；通过对不同消毒剂、不同作用时间其杀菌率的对比，确定不同消毒剂对B.suis的敏感程度。研究表明，B.suis对聚维酮碘溶液敏感性最强，10%聚维酮碘溶液1 000倍稀释作用3 min便能有效杀灭B.suis；其次戊二醛与癸甲溴铵混合溶液效果显著优于戊二醛单独使用，100倍稀释后可有效杀灭B.suis，1 000倍稀释后作用30 min可100%杀灭B.suis；而单独使用戊二醛，仅在10倍稀释时3～30 min能有效杀灭该菌，100倍稀释时作用30 min，其杀菌率仅达93%；而二氯异氰尿酸钠在4种消毒剂中消毒效果最不理想，其最高杀菌率仅为67%；因此，在布鲁氏菌病的防控中，消毒剂以聚维酮碘与戊二醛癸甲溴铵复方制剂为最佳选择。

布鲁氏菌；消毒剂；敏感性；杀菌率

布鲁氏菌是一种革氏阴性、小球杆状菌，无鞭毛，不形成芽孢，毒力菌株可有菲薄的荚膜，对营养要求高，生长缓慢。牛、山羊、绵羊和猪为常见自然病例，多种动物对牛、羊、猪3种布鲁氏菌以及同种布鲁氏菌间均有一定的易感性[1-3]。布鲁氏菌主要存在于病畜的乳汁、精液、脓汁、胎儿、胎衣、羊水、子宫阴道分泌物中，主要为经皮肤黏膜接触感染，经消化道、呼吸道感染。其中，病畜及被污染的水、垫料、饲草、奶及肉制品等是重要的感染源[4]。研究发现，布鲁氏菌在外界适宜的条件下可生存很长时间，抗灭活能力强，在土壤中可存活4～120 d，在粪便中可存活8～125 d，尿液中可达4～150 d，水中可达50～120 d，阳光照射可存活7～8 d。由于该菌对湿热、紫外线、以及常用消毒剂、抗生素和化学药物较敏感，因此在对抗布鲁氏菌病的过程中，环境、器具及废弃物的消毒就显得尤为重要。

消毒是在应用消毒剂的基础上，防控疾病传播及流行的可靠方法，在生产实践中具有重要作用。消毒剂是指能杀灭传播媒介上的微生物并达到消毒要求的制剂，一般含有一种或多种成分，虽然普遍具有广谱性消毒效果，但对于细菌/病毒等病原的敏感性也具有一些差异[5]。因此，通过试验确定不同消毒剂的消毒效果便显得尤为重要。为了确定常用消毒剂对布鲁氏菌的敏感性，本研究比较了聚维酮碘、戊二醛、二氯异氰尿酸钠等4种常用消毒剂对猪种布鲁氏菌的杀灭作用，从而为更好的防控布鲁氏菌提供了技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

猪种布鲁氏菌（Brucella.suis,B.suis）由山东绿都生物科技有限公司重点实验室保存；Tryptone soya agar（TSA）购自OXOID公司；Tryptic soy broth（TSB）购自BD公司；绿都金典（聚维酮碘10%）、喜卫酸（戊二醛5%+癸甲溴铵溶液5%）、绿都牧安（稀戊二醛5%）与二氯异氰尿酸钠（45%有效氯）购自山东绿都安特动物药业有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 B.suis的培养将B.suis以1%比例接种于5 mL TSB培养基上，置于摇床上，37℃180 rpm培养16～24 h，收获，置于4℃冰箱保存。

1.2.2 B.suis的菌落计数将上述B.suis的培养液进行10-7、10-8、10-9稀释，分别取0.1 mL接种与TSA培养基中，置于37℃培养箱中60～72 h，观察记录各个平皿上的菌落数，依据稀释倍数，计算每毫升原菌液所含细菌菌落总数。

1.2.3 B.suis对不同消毒剂敏感性试验将二氯异氰尿酸钠（45%有效氯）配制为200 mg/L，并将其与绿都金典（聚维酮碘10%）、喜卫酸（戊二醛5%+癸甲溴铵溶液5%）、绿都牧安（稀戊二醛5%）分别进行10×、100×、1 000×与10 000×稀释；依据菌落计数结果将B.suis菌液进行适当稀释，取0.1 mL菌液加入0.9 mL稀释后的消毒液中混匀，分别作用3 min、10 min与30 min，最后取0.1 mL加入TSA培养基中；同时将菌液进行10-8稀释，取0.1 mL加入TSA培养基中，作为对照；置于37℃培养箱中60～72 h，并进行菌落计数，并计算每组的杀菌率。

2 结果

2.1 B.suis培养与菌落计数

按常规方法将B.suis加入TSB培养基中扩大培养，并进行菌落计数，结果显示，该菌液每单位菌落数为33×109CFU/mL。

2.2 B.suis对不同消毒剂敏感性试验

2.2.1 B.suis对绿都金典（聚维酮碘10%）敏感性试验将B.suis菌液进行1×107倍稀释，取0.1 mL菌液分别加入0.9 mL稀释后的绿都金典（聚维酮碘10%）中混匀，作用3 min、10 min与30 min，菌落计数结果显示：对照组菌落计数结果显示为30×109CFU/mL；将该消毒液进行10×、100×与1 000×稀释后，与B.suis菌液作用 3～30 min，其杀菌率均能达到100%，证明可有效杀灭B.suis；但10 000倍稀释后，虽然其杀菌率随着与B.suis作用时间的延长而增高，但不能将B.suis彻底杀灭。（见表1）

2.2.2 B.suis对喜卫酸（戊二醛5%+癸甲溴铵溶液5%）敏感性试验对照组菌落计数结果显示为30× 109CFU/mL；将B.suis菌液进行1×107倍稀释后，与喜卫酸（戊二醛5%+癸甲溴铵溶液5%）分别作用3 min、10 min与30 min，菌落计数结果显示：将该消毒液进行10倍与100倍稀释后，与B.suis作用3～30 min，其杀菌率均至100%；当进行1 000倍稀释时，作用3 min、10 min，其杀菌率分别为85.2%与92.6%，作用30 min，其杀菌率为100%；进行10 000倍稀释时，其杀菌率随着作用时间的延长而增高，最高值为70.4%，显示不能有效抑菌。（见表2）

2.2.3 B.suis对绿都牧安（稀戊二醛5%）敏感性试验对照组菌落计数结果显示为30×109CFU/mL；将B. suis菌液进行1×107倍稀释后，与绿都牧安（稀戊二醛5%）分别作用3 min、10 min与30 min，菌落计数结果显示：将绿都牧安进行10倍稀释时，其抑菌率均为100%，但进行100倍、1 000倍及10 000倍稀释时，其抑菌率随着稀释倍数的增加而显著降低（p＜0.01），且抑菌率随着每个浓度消毒液与B.suis作用时间的延长而增高。（见表3）

2.2.4 B.suis对二氯异氰尿酸钠（45%有效氯）敏感性试验将B.suis菌液进行1×107倍稀释，取0.1 mL菌液分别加入0.9 mL稀释后的二氯异氰尿酸钠（45%有效氯）中混匀，作用3 min、10 min与30 min，最后取0.1 mL加入TSA培养基中，涂布均匀，置于37℃培养箱中60～72 h，并进行菌落计数。结果显示：B.suis对二氯异氰尿酸钠敏感性很低，当二氯异氰尿酸钠浓度达200 mg/mL时，其最高抑菌率为67%，因此该消毒剂不适于布鲁氏菌病的消毒。（见表4）

2.3 小结

通过4种消毒剂对B.suis杀菌率试验的研究，结果表明，该菌对聚维酮碘溶液敏感性最强，10%聚维酮碘溶液1 000倍稀释作用3 min便能有效杀灭B.suis；其次戊二醛与癸甲溴铵混合溶液效果显著优于戊二醛单独使用，100倍稀释后可有效杀灭B.suis，1 000倍稀释后作用30 min可100%杀灭B.suis；而单独使用戊二醛，仅在10倍稀释时3～30 min能有效杀灭该菌，100倍稀释时作用30 min，其杀菌率仅达93%；而二氯异氰尿酸钠在4种消毒剂中消毒效果最不理想，其最高杀菌率仅为67%。

3 讨论

表1 B.s uis对绿都金典敏感性试验-菌落计数(109CFU/mL)与抑菌率（%）结果

表2 B.suis对喜卫酸敏感性试验-菌落计数(109CFU/m L)与抑菌率（%）结果

表3 B.s uis对绿都牧安敏感性试验-菌落计数(109CFU/mL)与抑菌率（%）结果

表4 B.suis对二氯异氰尿酸钠敏感性试验-菌落计数(109CFU/mL)与抑菌率（%）结果

布鲁氏菌病（Brucellosis）是由布鲁氏菌感染引起的世界范围内的重要的人畜共患传染病，严重威胁着人和多种动物的生命健康，严重影响了我国畜牧业的健康稳定发展。近几年我国动物布鲁氏病的流行呈现上升趋势，因此，必须高度重视该病的防治。消毒是贯彻预防为主方针的一项重要措施，其目的是消灭环境中的病原体，切断其传播途径，从而抑制疫病继续蔓延。随着养殖规模及集约化程度的不断扩大，疾病的传播速度、范围及感染几率都在不断增加，因此有效杀灭环境中的致病微生物，控制疾病流行，是当前养殖业提高产能的有效途径[5]。喷雾、带畜禽消毒是养殖场日常工作的必要环节，而消毒剂的种类、特性及其合理使用与消毒效果密切相关[6]。目前市售消毒液按成分不同可以分为醛类、碘类、酚类、季铵盐类等多种，因此如果选择有效的消毒剂成为了消毒成败的关键因素之一[7]。

聚维酮碘属于碘伏类消毒剂，是由碘与聚乙烯吡咯烷酮络合而成的棕褐色液体，杀菌谱广，性质稳定，且刺激性小，可通过使菌体蛋白变性或抑制酶活性，而起到灭菌/抑菌的作用[8]。复方消毒剂一种新型的复合型消毒剂，其活性成分为戊二醛癸甲溴铵溶液，主要作用为破坏细菌表面蛋白，试验证明该消毒剂在实验室的条件下，1∶700倍稀释，10 min内，即可有效杀灭金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏杆菌与溶血性链球菌，效果显著优于单独使用其中一种消毒剂[9]。在本实验中，通过4种常用消毒剂对B. suis灭菌率的比较，实验证明，该菌对聚维酮碘溶液敏感性最强；其次为戊二醛+癸甲溴铵溶液、稀戊二醛溶液；而对二氯异氰尿酸钠敏感性最低，不能作为布鲁氏菌病的日常消毒使用。在消毒过程中，通常消毒效果随着消毒剂浓度增加及作用时间的延长，其杀菌/抑菌效率越强；在本研究中，也证实了该理论。但在实际应用中，随着消毒剂浓度的升高，其对活体组织(畜禽体)的毒性也相应增大，且部分消毒剂具有挥发性或需避光保存等特点。因此，对消毒剂的选择，应根据畜禽种类、受污染程度、使用方法、成本等因素确定。在杀灭B.suis的研究中，研究显示聚维酮碘（10%）的有效使用浓度为100～1 000倍稀释，也可用于皮肤及黏膜的消毒；戊二醛癸甲溴铵溶液有效使用浓度为100～1 000倍稀释；而单独使用戊二醛，进行10倍稀释有效，但出于对成本的考虑，不建议使用；而二氯异氰尿酸钠对B.suis不敏感，使用效果不佳。虽然本研究仅限于实验室研究，但该成果也必将为我国畜牧业的健康发展提供一些参考与技术支持。■

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Study on the Sensitivity of Brucella.suis to Four New Kinds of Disinfectants

Dong Bingmei1,Yang Limei2,Zhang Hanxia3,Lv Sufang2,LiFeng2*
(1.Shandong Lvdu Bio-industry Company,LTD.,BinZhou ShanDong,256600；2.Shandong Binzhou Animal Science &Veterinary Medicine Insitute,BinZhou ShanDong,256600；3.Zouping county animal husbandry and Veterinary Bureau,BinZhou ShanDong,256600)

In order to determine the bacteriostatic effect of new disinfectants on Brucella,we respectively mixed quantitative Brucella.suis(B.suis)with povidone iodine,glutaraldehyde,glutaraldehyde capric methyl bromide compound and dichloroisocyanurate.3min,10min and 30min later,0.1mL mixed liquor was coated on the TSA medium and colony counted.The research shows that the sensibility of povidone iodine was the highest to B.suis,and the povidone iodine solution (10%)can effectively kill B.suis by 1000 times diluted in 3 min.Secondly,the mixed solution of glutaraldehyde and capric methyl bromide was better than glutaraldehyde used alone.It can effectively kill B.suis by 100 times diluted,and 1000 times diluted for 30min.However,the glutaraldehyde can ffectively kill B.suis by 10 times diluted from 3min to 30min.When the glutaraldehyde was diluted 100 times,its sterilization rate decreased to 93%.The disinfection effect of two sodium dichloroisocyanurate is not ideal in the four kinds of disinfectants and its maximum bactericidal rate was only 67%.Therefore,in the four kins of the disinfectants,the povidone iodine and glutaraldehyde capric methyl bromide compound is the best choice to the prevention and control of brucellosis.

Brucella;Disinfectant;Sensitivity;Sterilizing rate

10.3969/j.issn.1008-4754.2017.1.042

山东省自然资金项目（ZR2013CQ005）,山东省农业技术推广项目（牛羊结核病和布病监测及净化技术推广）

董炳梅（1979-），女，助理研究员，硕士

*通讯作者：李峰，Email：dongbingmei_1998@126.com。