植物叶蛋白提取及脱色研究进展

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(1.南京林业大学林学院,江苏南京 210037; 2.江苏省农业科学院农业资源与环境研究所,江苏南京 210014)

植物叶蛋白提取及脱色研究进展

施曼1,2,高岩2,*,易能2,张维国2,严少华2,*

(1.南京林业大学林学院,江苏南京 210037; 2.江苏省农业科学院农业资源与环境研究所,江苏南京 210014)

植物叶蛋白是一种潜在的可再生蛋白资源,营养价值丰富。叶蛋白的高效率、优质提取是实现其高价值资源化利用的前提。本文介绍了常用的叶蛋白提取方法以及获取优质叶蛋白使用的脱色方法,阐明了各方法的优缺点。在此基础上结合已有的实践经验总结了植物叶蛋白提取及脱色存在的问题,并针对面向产业化发展的叶蛋白提取方法及脱色方法提出了优化建议,以期为高品质叶蛋白的进一步研发和应用提供参考。

叶蛋白,提取方法,脱色方法,资源化利用

植物叶蛋白是以新鲜植物的茎叶为原料,经压榨后从其汁液中提取的绿色蛋白浓缩物[1],简称叶蛋白(Leaf protein concentration,LPC),富含人体所需的必需氨基酸和非必需氨基酸,是一种原料丰富、营养价值高、无胆固醇、可再生的新型蛋白资源。高效率地提取优质的植物叶蛋白可为人类膳食、饲料加工、养殖业、畜牧业提供丰富的蛋白质资源,满足世界人口剧增和人民生活水平提高所带来的对优质蛋白的需求。同时,还可解决工农业上的农产品废弃物资源浪费问题,例如利用水生植物修复污染水体后,植物修复材料存在后续处置难题,而某些植物修复材料如漂浮水生植物水葫芦,对氮的吸收转化效率极高,在吸收水体过量氮的同时使其体内贮存丰富的粗蛋白;块茎粮食作物可为人类提供食物,叶片常被丢弃,如木薯,其叶片中蛋白质含量较高,干物质的蛋白含量达15%～40%[2],若不加以利用,实为资源的浪费。因此,植物叶蛋白的研究具有多种益处。

目前对于植物叶蛋白的研究主要集中于叶片粗蛋白的提取方法、工艺优化及其营养价值等[3-7]方面,对叶蛋白脱色及如何获取高品质、高价值叶蛋白方面的研究较少,导致植物叶蛋白的应用范围窄、推广度不够。一般来说,提取得到的粗蛋白颜色呈墨绿色或棕色[8],适宜作为动物饲料用。经过脱色后,其呈米白色,可经适当加工后添加入人类膳食当中,或作为食品添加剂等,其应用范围拓宽且具有较高的附加值。本文主要从植物叶蛋白的原料来源、提取方法及脱色处理等方面对国内外植物叶蛋白的研究进展进行总结,期望为植物叶蛋白提取方法的改进、脱色方法的建立及应用的进一步拓展提供借鉴。

1 植物叶蛋白主要原料及其特性

理论上,任何植物的叶片都含有蛋白质。因此任何植物都可以作为叶蛋白的原料来源,但考虑到成本问题,符合以下一种或几种条件的植物更适宜作为叶蛋白提取的主要原料:叶蛋白含量高、生长速度快、种植面积大、可刈割后再生等条件,因为达到这些条件的植物可以在短时间内提供大量的叶蛋白,适宜作为叶蛋白产业化生产的材料。目前,国内外叶蛋白研究的主要原料为苜蓿、水葫芦、木薯、甜菜、桑叶、黑麦草、烟草等。苜蓿集蛋白含量高、种植面积大、生长速度快等优点于一体,成为叶蛋白研究最多的植物,其提取的叶蛋白可作为食品添加到人类膳食中,也可作为兽禽鱼的饲料。中国作为世界上苜蓿品种资源较为丰富的国家,其种植面积达130万公顷[9],欧洲和北美也广泛种植,全世界苜蓿种植面积约3200万公顷[10],其粗蛋白含量约2600 kg/ha[11]。木薯干物质的蛋白含量达15%～40%,在巴西各地区被广泛种植,其木薯生产量占世界产量的13%,平均每公顷木薯的干物质可达2 t,因此其叶片被认为是一种农产品的废料,对其叶蛋白的提取和利用减少了木薯叶片资源的浪费[2]。水葫芦具有叶蛋白含量高、繁殖速度快、分布范围广的特点,其干物质中粗蛋白含量约10.5%,是叶蛋白提取的另一个植物材料。非洲等热带国家中,大量的河流、湖泊、池塘等水域遍布水葫芦,孟加拉国的港口城市——吉大港内约60%的池塘和湖泊长满水葫芦[12],是巨大的叶蛋白资源库,对其叶蛋白的提取不仅可以提供丰富的蛋白质资源,而且可以解决水葫芦疯狂生长造成的环境问题。

植物叶蛋白根据其在水中的溶解性主要分为“亲水蛋白”和“亲脂蛋白”两类[13]。“亲水蛋白”即可溶性蛋白,约占叶蛋白总量的50%,主要由叶绿体基质中的核酮糖1,5-二磷酸羧化/加氧酶组成[14],约占可溶性蛋白的30%～70%[15]。这部分蛋白呈白色,无异味,是人类食品应用的优选蛋白[16],传统方法提取的粗蛋白主要由这部分蛋白构成。“亲脂蛋白”即不溶性蛋白,约占叶蛋白总量的50%,主要由膜蛋白和色素结合蛋白组成[8,16],在传统的提取方法中,这部分蛋白多存在于被丢弃的残渣中,是叶蛋白提取得率不高的主因。在大多数食物系统中,溶解度是蛋白质最关键的功能特性,影响着胶凝、乳化和起泡等其他功能特性[16],也影响着食品的感官质量。因此,可溶性蛋白更适宜食品级生产应用。

2 植物叶片粗蛋白的提取方法

目前,提取植物叶片粗蛋白效率较高的通用方法主要有碱溶酸沉法、乳酸发酵法及膜过滤法等。传统单一的提取方法,如直接加热法、酸沉法、碱沉法、盐析法等应用范围较窄,且蛋白质提取得率一般,在此不做详细介绍。

2.1叶蛋白常规提取法

2.1.1 碱溶酸沉法 碱溶酸沉法是目前应用较多的方法,也是较为传统的方法,集碱溶、酸沉、直接加热法于一体,利用蛋白质等电点沉淀及高温变性的特点,通过对pH的调节及温度的控制,使蛋白沉淀,得到叶片的粗蛋白。该方法可以较好地提取叶蛋白,但缺点是提取步骤较为繁琐,特别是对pH的调节在生产应用上会带来一定的阻碍。T.M. ABO BAKR等[17]用碱溶酸沉法提取水葫芦的叶蛋白,用0.01 mol/L NaOH与切碎的叶子混匀,料液比1∶5,然后放入捣碎机捣10～15 min,用纱布过滤后得提取液,加入1 mol/L HCl调节pH至4.5,最后将溶液加热到75 ℃,完成蛋白质的沉淀,沉淀3000 r/min离心15 min,并用水清洗后冷冻干燥,最终得到水葫芦叶片的粗蛋白提取物,提取物中粗蛋白含量为49.6%。A.E. Ghaly等[18]采用碱溶酸沉法对苋菜、豇豆、荷兰豆、南瓜、甘薯、卷心菜等六种植物提取叶蛋白,采用100 g叶片、70 mL 0.1 mol/L 的NaOH与170 mL蒸馏水混合打浆,过滤后取上清液,用1 mol/L HCl调节pH至3.5,最后加热至蛋白沉淀。以干基计,六种植物中南瓜和苋菜的叶蛋白含量最高,分别为11.75%和10.7%。

2.1.2 乳酸发酵法 乳酸发酵法是近年来逐渐受到重视的一种成本较低的叶蛋白提取方法。该方法将菌种在恒温下培养,接种到培养基中,取多次活化后的发酵液与一定比例的叶片汁液混合,利用发酵液产生的乳酸,降低混合液的pH,使其达到蛋白质等电点,从而产生沉淀。该方法安全、便捷、成本低,缺点是发酵过程不好控制,且对蛋白质有一定程度的降解,降低叶蛋白的得率。目前常用的菌种主要是乳酸杆菌和家制泡菜酸液。曾凡枝等[19]采用直接发酵法,在苜蓿汁液中接种乳酸菌107个/mL,34 ℃发酵8 h,离心后取上清液将其作为发酵酸与打浆过滤后的滤液混合,得到发酵法的最佳工艺为体积比(发酵酸体积/滤液体积)2∶1,发酵酸循环使用1次,沉淀10 min,其最大提取率为38.01%。刘鹏等[20]用家制泡菜的酸液作菌种,加入到已处理好的植物叶片榨汁液中,30 ℃恒温培养,在pH<4.0时取上部清液作为叶蛋白沉淀剂进行叶蛋白提取。比较了直接加热法、盐酸法与发酵酸法制取的紫云英蛋白聚凝物中,发酵酸法所得的粗蛋白含量最高,达50%。V.N. PANDEY等[21]采用一种含嗜酸乳杆菌和乳酸链球菌的发酵乳制品——印度凝乳作为发酵剂,将其添加到南苜蓿提取液中,35 ℃培养12 h,过滤后在60 ℃真空中干燥,所得提取物中粗蛋白含量达57.19%。

2.1.3 膜过滤分离提取法 膜过滤技术是以压力为推动力,依靠膜的选择性,将液体中的组分进行分离的方法,包括微滤(MF)、超滤(UF)、纳滤(NF)和反渗透(RO)四种,在食品工业及水处理等领域被广泛使用。膜过滤技术成本适中、空间需求小、操作简单[22],更因其高截留率、无化学添加物、优良的渗透品质等优势[23-25],常被用来分离植物叶蛋白,其中,微滤和超滤是两种常用的方法。Wen xiang Zhang等[26]采用微滤(MF)和超滤(UF)两种方法提取苜蓿叶蛋白,分别采用超滤杯死端过滤(DA)、旋转盘式动态错流过滤(CRDM)及旋转盘式死端过滤(DRDM)三种过滤方式进行研究,认为微滤中的旋转盘式动态错流过滤(CRDM)可以获得最高的蛋白生产率,提取叶蛋白纯度达93%,具有较好的工业化应用的潜力。为进一步改善苜蓿汁液叶蛋白过滤工艺,Wenxiang Zhang等[27]又选择了具有更高防污力、更好选择性、更高的渗透通量及更好的过滤效果的超滤膜,研究其过滤的工艺参数,优化操作条件以提高过滤通量、改善分离效果,优化后的操作条件为:US100P超滤膜,温度55 ℃,跨膜压6巴,转速2000 r/min。Werner Koschuh等[28]采用超滤技术提取黑麦草汁液中的叶蛋白,粗蛋白提取率达59%,而传统的直接加热法只有45%,采用超滤技术对苜蓿汁液粗蛋白的提取率达52%。

2.1.4 其他方法 除了常规的提取方法外,还有一些方法使用频率较少,但具有其特殊性,如醋酸乙醇溶液浸泡法、低温醇洗法等。Oyeyemi Adeyemi等[29]收集水葫芦的叶子清洗后用5%醋酸在加热罩中热烫5 min,用去离子水清洗并在室温下晾干。之后浸入95%的乙醇溶液中吸收6 h以除去脂肪,然后在45 ℃保温箱中烘干获取叶蛋白,获取的叶蛋白在研磨机中磨碎并真空贮藏。该法操作简单,可在获取叶蛋白的同时除去色素及酚类化合物等,缺点是对溶剂需求量较大。刘伟等[30]将在4 ℃冰箱中预冷1 h的水葫芦叶片放入打浆机中,迅速加入4倍重量的已预冷至-20 ℃的95%的乙醇,打浆30 min,之后过100目筛,除去粗纤维,得到蛋白乙醇混合物,滤纸过滤后得叶粗蛋白,用95%乙醇反复醇洗至无绿色为止。该法可以去除叶蛋白的色素及酚类化合物,免去了叶蛋白脱色的步骤,缺点是提取过程要在-5 ℃冰箱中进行,全程低温操作,耗能较多。

2.2叶蛋白辅助提取法

叶蛋白的提取还可以在传统常规方法的基础上增加酶或超声波等手段辅助提取,提高细胞破碎程度,增加叶蛋白的溶解度,以提升叶蛋白提取得率。

2.2.1 酶辅助法 纤维素酶可以有效地破坏植物细胞壁结构,使细胞内的物质更容易提取,有利于提高叶蛋白的提取率,且酶解条件温和,无污染[31],适宜纤维含量高的植物辅助提取叶蛋白。朱天明等[32]以桑叶为原料在酸加热法的基础上采用纤维素酶辅助提取叶蛋白,得到桑叶叶蛋白的最佳提取工艺条件为:固液比1∶38 (g/mL),酶解时间为2 h,加酶量为4%,此时5 g桑叶经酶解后总溶出的蛋白质质量为49.056 mg。M. Vergara-Barberán等[33]在有机溶剂提取法的基础上利用纤维素酶辅助提取油橄榄的叶蛋白,优化的提取参数为30%氰化甲烷溶解液氮研磨后的叶片粉末,用5%的纤维素酶1.5 L在pH5.0、55 ℃下提取15 min。

2.2.2 超声波辅助法 与传统提取方法相比,超声波辅助是一种简单、快速、平价、有效的方法。超声波具有增溶作用,在进行叶蛋白提取时,能有效地打破细胞边界层,大大提高提取速率,缩短提取时间,并且能有效降低提取温度,保护蛋白的活性[34]。许英一等[35]在碱溶酸沉法的基础上采用超声波辅助提取苜蓿叶蛋白,以1∶2的固液比进行提取时最佳工艺条件为:温度40 ℃,pH8.5,超声时间30 min,粗蛋白提取率为51.09%,与单纯的碱溶法相比,缩短了提取时间且叶蛋白的提取率提高了10%～15%。梁丽琴等[36]在酸溶法的基础上采用超声波辅助提取扁核木叶蛋白,酸溶法提取的最佳工艺是:时间25 min、温度45 ℃、液料比8、pH3.6,此时,扁核木叶蛋白的提取率为70. 37%;超声波辅助酸溶法提取扁核木叶蛋白的最佳条件:时间20 min、温度40 ℃、液料比12、pH4.2,此时,扁核木叶蛋白的提取率可达87.90%,与传统的酸溶法相比,提取率提高了17.3%。

2.2.3 纳米器件辅助法 随着纳米科技的发展,纳米材料在环保、医学、生物等领域发挥了巨大的作用,吸附性纳米材料、纳滤技术及纳米光催化技术等均给环保、医学及生物领域带来了新的发展契机。罗芳等[37]采用纳米器件研究水葫芦、番茄和菠菜的叶蛋白提取率,认为用纳米高能片处理过的植物提取液能提高蛋白质在提取液中的溶解度,进而提高叶蛋白的提取率,增幅为10%～30%。

3 植物叶蛋白的脱色

植物高价值叶蛋白的提取还包括叶蛋白的脱色步骤。除有机溶剂提取外,一般提取方法获得的叶蛋白呈墨绿色、棕色。绿色主要是含有叶绿素而呈现的颜色,而棕色主要是由于蛋白质与多酚类化合物结合呈现出的颜色[8]。这些颜色限制了植物叶蛋白的商品使用范围及商业价值,因此,脱色是高价值叶蛋白提取过程中不可缺少的一环。

3.1吸附法

吸附法是在多糖提取、废水处理等领域常用的脱色方法,常用的材料是活性炭、大孔树脂等。笔者对水葫芦叶蛋白的脱色实验发现活性炭可能不是一个很好的选择,因为它不仅吸附色素还会吸附叶蛋白,活性炭处理时间短脱色效果差;处理时间长,则叶蛋白损失严重,且活性炭会对叶蛋白产生一定程度的污染。大孔树脂吸附法操作繁琐,也会造成叶蛋白较多的损失。因此,除了特殊蛋白的提取外,也不建议其用于叶蛋白脱色。

3.2有机溶剂处理法

有机溶剂法是目前叶蛋白脱色处理常用的方法,利用色素易溶于有机溶剂、难溶于水，而蛋白难溶于有机溶剂的特性达到去除色素的目的。常用的有机溶剂为乙醇、丙酮、甲醇等,这三种溶剂均被划分为食品级溶剂,不仅可以去除叶绿素等色素,也可以消除酚类化合物,从而达到脱色的效果。该方法脱色效果较好,但缺陷是对溶剂的消耗较多。Angelica Tamayo Tenorio等[8]采用80%的丙酮对含色素的甜菜粗蛋白进行洗涤脱色,连续洗5次后,大多数叶绿素被清除,叶蛋白变为米白色,蛋白含量基本不变。Bals等[38]用95%的乙醇去除苜蓿叶蛋白中的叶绿素,得到不含叶绿素的叶蛋白。Teng,Z.等[39]采用甲醇与水体积比40∶60的混合液可有效去除烟草叶蛋白中的酚类化合物。

3.3超临界CO2流体萃取技术

超临界CO2流体萃取技术是提取生物活性物质较合适的一种技术,该技术安全、无毒、容易获得、易与最终提取物分离,且能保持提取物的生物特性[40-42],是一种绿色环保的分离技术。其在叶蛋白脱色方面的应用也有一定的历史。FABIO FAVATI等[43]在1988年就利用超临界CO2流体萃取技术将苜蓿叶蛋白中的胡萝卜素及叶黄素萃取出来,一方面达到了叶蛋白脱色的目的,另一方面得到了另一种增加叶蛋白经济价值的副产品。提取工艺为10～70 MPa的压力、55 ℃的温度及5～6 L/min的CO2流速。在压力超过30 MPa时90%的胡萝卜素可被除去,但叶黄素的去除则需要70 MPa的压力。除了胡萝卜素、叶黄素外,超临界CO2流体萃取技术也可以萃取叶绿素及酚类化合物[44-45],除了脱色和获取另一种副产品之外,超临界CO2流体萃取技术在分离叶蛋白色素时还有另一个优势,即CO2与提取液中的水接触时,会形成游离的碳酸,将溶液的pH降至3左右[46],在将色素和多酚溶解在超临界CO2流体的同时,导致叶蛋白沉淀。

4 植物叶蛋白研究展望

4.1叶蛋白提取存在的问题及方法优化

目前对于植物叶蛋白的研究仍然集中于提取方法上,低成本、方法简单、安全无毒、叶蛋白得率高、品质佳、且能广泛用于工业化生产的提取方法仍然是目前叶蛋白研究领域的一大难点。传统的叶蛋白提取方法集中于可溶性蛋白的提取,而难溶性蛋白则成为废弃物,这是叶蛋白提取得率不高的主要原因。笔者认为若要提高植物叶蛋白的得率,可以从两方面着手。一方面,鲜叶打浆越碎越好,植物细胞的破碎程度直接影响细胞内蛋白在提取液中的溶解程度,蛋白溶解度越高,提取的蛋白得率越大,因此高速打浆机或高速搅拌机的选择是叶片机械破碎的关键,是提高叶蛋白提取率的第一步。另一方面,提取可溶性蛋白后的残渣可进行针对膜蛋白的进一步加工提取。蛋白质组学上的提取法中有一种采用食品级表面活性剂提取叶片膜蛋白的方法,可为膜蛋白的产业化提取提供灵感,如表面活性剂相分区法[8]。Triton X-100,Tween 80等均是常用的食品级表面活性剂,这些表面活性剂有增溶作用,可以增加膜蛋白在溶液中的溶解度,将与脂膜、其他蛋白、色素等相结合的蛋白分离出来,使其成为胶束状态[14],再通过离心等步骤将其分离出来。Tween 80常被用来使膜蛋白增溶,其在食品中添加量可达1 wt%～10 wt%[47]。

很多叶蛋白提取方法主要针对实验室研究进行,将其应用于产业化发展还有一定的阻碍,在面向产业化时还需要进行叶蛋白提取方法的优化。传统的碱溶酸沉法提取过程较为繁琐,特别是pH调节这一环节,因需要在混匀的汁液中用pH计测定其pH,精确度难以控制,给叶蛋白的产业化应用带来较大的阻碍,因此笔者认为可将方法中提取液与植物叶片的量固定,探索出调节至某一pH时所用的酸量,使其成为定量的提取方案,从而免去pH调节这一环节,简化提取过程。此外,针对植物叶蛋白提取的新型方法也应继续开发,随着科技的发展,很多天然无毒的提取试剂及分离技术不断更新,比之传统方法更为安全、简便,可以为叶蛋白的产业化发展提供更多契机,如壳聚糖、海藻酸钠等试剂的使用。

4.2叶蛋白脱色存在的问题及建议

传统方法提取的叶蛋白一般呈墨绿色或棕色,颜色和口感均限制了其应用范围及商业价值。目前针对叶蛋白的脱色常分为两类:一类是叶蛋白提取前脱色,一类是提取后脱色。前者主要是采用有机溶剂打浆或浸泡,将色素和酚类化合物去除,然后进行叶蛋白的提取和提纯,这将大大减少后期脱色的工作,甚至免去脱色的步骤,如低温醇洗法。后者是采用传统的方法提取叶蛋白后,将获得的叶蛋白专门脱色,采用有机溶剂或超临界CO2流体萃取等化学分离手段,获得高品质叶蛋白。然而,无论是提取前还是提取后采用有机溶剂法脱色对溶剂消耗量较大,成本较高。超临界CO2流体萃取以CO2为萃取剂,溶剂成本较低,但设备投资较高。两者在脱色方面均存在缺陷,因此探索一种针对蛋白分离的低成本、安全、便捷的脱色方法是获取高品质蛋白的必要途径。

在实验中发现不同方法提取出的叶蛋白颜色差异较大,以水葫芦为例,采用水溶酸沉法提取的叶蛋白呈浅棕色,碱溶酸沉法提取的叶蛋白呈棕色,酸沉法提取的叶蛋白呈深绿色。因此,采用颜色较浅的粗蛋白进行脱色处理对实际生产和应用具有较大的意义。筛选粗蛋白颜色较浅的提取方法配合脱色是获取低成本、高品质叶蛋白的有效途径。

植物叶蛋白是一个巨大的全球性资源,具有广阔的市场前景和商业潜力,相信随着科技的发展,高品质植物叶蛋白的资源化利用将会越来越深入。

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Researchprogressonthemethodsforleafproteinextractionanddecoloration

SHIMan1,2,GAOYan2,*,YINeng2,ZHANGWei-guo2,YANShao-hua2,*

(1.College of Forestry,Nanjing Forestry University,Nanjing 210037,China; 2.Institute of Agricultural Resources and Environment,Jiangsu Academy of Agricultural Science,Nanjing 210014,China)

Leaf protein concentrate(LPC)is a valuable and renewable protein resource with high nutritional quality. How to efficiently extract high quality leaf protein is an essential prerequisite to achieve commercial application and make profit. In this review,we summarized the methods commonly used for leaf protein extraction and decoloration,as well as the advantage and disadvantage of different methods. Based on the summary and our previous research,we addressed some of the existing problems for leaf protein extraction and decoloration,and proposed some suggestion on how to optimize the methods when using them in the industry. We expect this critical review can provide some valuable information for improving the potential development of high quality LPC utilization.

leaf protein concentration;methods of extraction;methods of decoloration;resource utilization

2017-03-24

施曼(1990-),女,博士研究生,研究方向:植物资源利用,E-mail:961221529@qq.com。

*

高岩(1978-),女,博士,副研究员,研究方向:富营养化水体生物修复及机理研究,E-mail:jaas.gaoyan@hotmail.com。严少华(1956-),男,博士,研究员,研究方向:富营养化湖泊治理研究,E-mail:shyan@jaas.ac.cn。

国家自然科学基金项目(41571458,41471415);农业部行业专项(201203050-6);江苏省农业科技自主创新江苏省农业科学院重大成果培育项目(ZX(15)1002);基于辐射技术的高性能变性淀粉及其高聚物创制与应用关键技术研究(CX(14)2136)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)21-0342-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.066