蛹虫草纤溶酶研究进展

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(北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心; 北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京 100048)

蛹虫草纤溶酶研究进展

刘英丽,丁立,毛慧佳,王静*,龚凌霄

(北京工商大学 北京食品营养与人类健康高精尖创新中心; 北京市食品添加剂工程技术研究中心,北京 100048)

蛹虫草是我国一种传统的药食两用真菌,其中的纤溶酶是近些年来发现的一种新型的纤维蛋白溶解酶。本文就蛹虫草纤溶酶的产酶条件、分离纯化、酶学性质、生物活性以及在分子生物学等方面的研究进展进行综述,为期为以后的研究提供一定的参考及有益借鉴。

蛹虫草,纤溶酶,研究进展

纤维蛋白是人体及动物体内形成血栓的主要蛋白成分,纤溶酶是纤维蛋白溶解酶的一个总称。据统计,心脑血管疾病是造成人类死亡的主要原因[1],而血栓形成是导致心脑血管疾病的主要因素,寻找有效治疗血栓的药剂引起了人们的广泛关注。目前应用于临床治疗血栓的药剂主要是一些纤溶酶原激活剂和类胞浆素酶,如组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)、尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)和链激酶等[2-3]。通常这些试剂具有一定副作用,如出血和堵塞并发症、纤维蛋白降解特异性较低、过敏反应及价格昂贵等[3-4]。因此,人们开始把关注点更多的放在一些天然来源的物质以期提取出没有或者具有较小副作用的、价格低廉的纤溶酶来替代现有的治疗血栓的药物。在过去的几十年里,已经有不少科学家从不同来源的生物中分离纯化出具有较高的纤维蛋白溶解活性并能影响凝血作用的蛋白酶,这些天然物质主要包括环节动物类、蛇毒液、昆虫、草本植物、真菌及细菌等[5-9],分离出的具有纤溶活性的蛋白酶也是性质各异,各有优缺点。

蛹虫草,世界性分布,我国主产于云南、吉林和辽宁省,又名北冬虫夏草,属于子囊菌门,肉座菌目,虫草菌科,虫草属[10],是一种中国传统的药食两用的大型真菌类物质,因与冬虫夏草有类似的结构和功能而备受关注。其含有的生物活性成分主要有虫草素、虫草酸、虫草多糖、甾醇及酶类等[11],具有抗肿瘤[12-13]、抗氧化[14-15]、提高免疫力[16-17]、消炎[18]、抑菌[19]等功能,被认为是冬虫夏草的理想替代品。纤溶酶作为蛹虫草这一珍贵资源中的另一种天然活性物质,具有溶栓抗脂等功能,与目前临床应用的治疗血栓药物相比,具有安全可靠,特异性高,价格低廉等优势。自Kim等[20]从蛹虫草发酵液中分离纯化出一种纤溶酶后,陆续有研究者从蛹虫草的发酵液、菌丝体及子实体中分离纯化出不同性质的纤维蛋白溶解酶,开辟了另一提取纤溶酶的绿色资源。本文就蛹虫草纤溶酶的产酶条件、分离纯化、酶学性质、溶栓抗脂效果以及在分子生物学研究等方面概述其进展,并就研究中存在的问题进行总结,为蛹虫草纤溶酶的深入开发提供思路。

1 产纤溶酶蛹虫草菌株的产酶条件

近些年来,不少研究者对蛹虫草产纤溶酶的水平进行了报道。王玉等[21]以大米为主料,通过固体培养的方式得出产纤溶酶的最佳条件为:麸皮和大米以1∶1的比例为主料,培养基加水量75 g/100 mL,无机盐CaCl2和(NH4)2SO4的添加量分别为0.1 g/100 mL和2 g/100 mL,培养基初始pH自然,接种量25 g/100 mL,培养时间5 d,固体发酵物的纤溶酶浸提时间为4 h时纤溶酶活力达(167±1) U/mL;周伏忠等[22]利用蛹虫草菌丝体液体发酵离心得上清液作为粗酶液,发现通过条件优化的菌丝体液体发酵产纤溶酶的适宜碳源为玉米粉(2%)和蔗糖(2%),氮源为豆饼粉(5%)和玉米浆(8%),培养基中适量添加MgSO4(0.05%)、KH2PO4(0.1%)和CaCl2(0.05%)、MnSO4(0.05%)等无机盐,发酵pH4.5～5.5,温度22～24 ℃,培养时间6～7 d,最高酶活可达78.5 U/mL;林群英等[23]也是利用液体发酵得出产纤溶酶的最佳碳源为乳糖,最佳氮源为蚕蛹粉,其培养基含量均为10 g/L,再加入5 g/L的酵母浸膏时,获得的纤溶酶活性高达143.26 U/mL;白伟芳等[24]采用液体发酵的菌株产酶最佳营养条件为2%葡萄糖,2%蛋白胨,碳氮比为1∶1,最佳环境条件为温度25 ℃,pH6.0,装液量 60 mL,发酵周期 9 d,接种量 2%,转速 150 r/min,在此条件下,发酵液纤溶酶活力可达到 111.85 U/mL;陈慧鑫等[25]采用发酵罐对蛹虫草进行深层扩大培养,蛹虫草深层培养产纤溶酶的最适培养条件为蔗糖2%、豆饼5%,23 ℃培养5 d,培养基初始pH为自然(6.0左右),10 L发酵罐在搅拌转速100 r/min和通风量为600 L/h的条件下纤溶酶活力达286.21 U/mL。可见,不同发酵条件和发酵方式对蛹虫草纤溶酶的产酶条件影响较大,依据菌株的性质差异,进行优化处理可以提高酶活。

2 蛹虫草纤溶酶的分离纯化

分离纯化是纤溶酶酶学性质分析的前提,获得纯品对于进一步研究其性质、结构、功能及其相互关系至关重要。现有的分离纯化技术主要是盐析、疏水相互作用层析、离子交换层析、凝胶过滤色谱等几种技术的综合利用。对于蛹虫草纤溶酶的分离纯化大体也是这几种技术的综合利用。Dubok等[26]通过将新鲜蛹虫草子实体与50 mmol/L磷酸盐缓冲液(pH7.4)混合磨成匀浆,利用硫酸铵得蛋白沉淀,离心用磷酸盐缓冲液复溶沉淀,过透析袋除盐,超滤浓缩后过DEAE-Sepharose FF离子交换柱,用0～5 mol/L线性梯度浓度的NaCl溶液洗脱,合并具有酶活收集液后用PD10柱脱盐后过HiLoad 16/60 Superdex 200柱,用50 mmol/L磷酸盐缓冲液洗脱,合并酶活收集液后超滤浓缩,接着过HiLoad 16/60 Superdex 75柱,洗脱浓缩后经SDS-PAGE检测其分子质量为34 kDa,纯化倍数为86.1倍,回收率为13.7%,比活力为499.6 U/mg;Kim等[20]利用 DEAE Sephadex A-50 离子交换柱,Sephadex G-75凝胶过滤色谱和Superdex 75柱分离纯化出蛹虫草液体发酵液中的纤溶酶,经SDS-PAGE检测得到一单一条带,分子量为52 kDa,纯化倍数为191.8倍,回收率12.9%;Cui等[27]只用了两步-硫酸铵盐析、过Superdex 75柱就从蛹虫草液体发酵液中得到一种达到电泳纯的纤溶酶,其分子量为27.3 kDa,纯化倍数为89倍,回收率为6%,但比活力仅为1.77 U/mg;刘晓兰[28-29]和张雯舒[30]运用同样的分离纯化策略(硫酸铵盐析、Sephadex G-25 凝胶色谱、Phenyl-Sepharose HP疏水相互作用色谱、CM-Sepharose FF弱阳离子交换色谱和Superdex 75凝胶色谱)分别从蛹虫草有性和无性深层培养液中各分离出两种纤溶酶,前者获得的两种酶的相对分子质量分别为28 kDa和32 kDa,纯化倍数为36.07和41.33,回收率为5.79%和4.00%,其比活力分别为1467.44 U/mg和1681.58 U/mg,后者针对分离出的纤溶酶Ⅱ进一步纯化,最终产物分子量为32 kDa,纯化倍数为30.07倍,比活力800.46 U/mg。从以上结果大致可知不同来源纤溶酶活力不同,分子量在30 kDa左右,但是不排除今后发现的其他来源的纤溶酶表观分子量有差异。

3 蛹虫草纤溶酶的酶学性质

酶学性质的分析研究对于酶后续的生产和应用有重要的意义。张鹤[31]从蛹虫草液体发酵提纯精制了一个分子量28 kDa的纤溶酶,发现Aprotinine(抑肽酶,丝氨酸蛋白酶抑制剂)和SBTI(胰蛋白酶抑制剂)对其酶活性有抑制作用,推测这种酶可能是丝氨酸蛋白酶,可顺次降解人血纤维蛋白的α、β和γ链,这与刘晓兰[29]和张雯舒[30]得出的结论一致。此外,这个蛋白酶不但能直接降解血纤维蛋白,而且具有激活纤溶酶原转化成纤溶酶的作用;刘晓兰[29]提纯的纤溶酶Ⅱ的分子量为32 kDa,等电点为9.3±0.2,最适pH和温度为7.4和37 ℃,Ca2+和Cu2+对酶活性有增强作用,Fe3+强烈抑制酶活性,EDTA(乙二胺四乙酸,金属蛋白酶抑制剂)对其活性影响不大,巯基基团反应试剂强烈抑制酶的活性,说明该酶活性部位不含金属离子,巯基是该酶活性表达的必需基团;Cui等[18]的研究表明纤溶酶的最适pH和温度为6.0和25 ℃,Mg2+和Fe2+能增强酶活性,而EDTA和Cu2+则抑制酶活性,N端氨基酸测序表明其与昆虫体内的胰蛋白酶具有很高的相似性,而与其他药用真菌内的纤溶酶序列没有显著的同源性;Dubok等[26]的研究结果显示蛹虫草纤溶酶的最适pH和温度为7.0和40 ℃,酶活性受到PMSF(苯甲基磺酰氟,丝氨酸蛋白酶抑制剂)、TPCK(L-1(对-甲苯磺酰)苯丙胺酰氯甲酮,胰凝乳蛋白酶抑制剂)、1,10-邻二氮菲、Cu2+和Ba2+的完全抑制,也受到Aprotinine、EDTA和EGTA的显著抑制,对合成基质N-succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-nitroanilide具有特异性,说明它可能是一个同属于丝氨酸蛋白酶类和金属蛋白酶类的蛋白酶;而陈晓飞等[32]的研究也表明,金属离子Ca2+和Fe2+对蛹虫草纤溶酶有显著激活作用,抑制剂中PMSF对酶活性抑制作用较小,而Aprotinine、EDTA和EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸,金属蛋白酶抑制剂)对其纤溶活性均有较显著的抑制作用,说明该酶可能是一种新的纤维蛋白溶解酶。因此,不同来源的纤溶酶最适温度和pH略有差异,但是受抑制剂抑制作用的类型各异,可能分属于不同的蛋白酶家族,除了丝氨酸蛋白酶类,还有可能属于金属蛋白酶类,或者两者兼具,但需进一步验证。

4 蛹虫草纤溶酶的生物活性研究

蛹虫草纤溶酶作为一种新发现的来自大型药用和食用真菌的新型纤溶酶,对于其活性功能研究较多的集中于溶栓抗脂方面,主要实验包括体外模拟和体内实验。体外最常用的检测方法是取血液体外放置自然或促进形成血块,称取质量,加入纤溶酶,共孵育一段时间后再称取血块质量,计算溶解率。体内实验主要是建立动物血栓模型或血脂模型,包括外力诱导和化学物质诱导等方式[33-35]。刘晓兰[29]进行体外纤溶酶溶解血块的实验表明随着时间的延长,血块逐渐溶解,6 h内大体溶解完全,将纤维蛋白原、凝血酶和纤溶酶按不同方式混合,结果表明该酶具有很好的溶栓效果,对凝血酶具有一定的裂解作用,可作为抗凝剂使用;崔莉[36]利用提纯的纤溶酶进行体外毛细管血凝块溶解实验表明:与生理盐水对照组相比,注入蛹虫草纤溶酶的毛细管血凝块很快溶解,毛细管阻塞消失。体外血凝块溶解实验表明与尿激酶阳性对照组相比,纤溶酶具有很好的血块溶解效果。利用SD大鼠建立的血小板性动脉血栓和ADP诱导的大鼠血小板凝集模型证明纤溶酶对其均具有明显的抑制作用,空白对照组血栓湿重(123.4±25.4) mg,血小板聚集率为29.25%;阳性对照组(尿激酶250 U/kg)血栓湿重(59.3±26.2) mg,血小板聚集率(尿激酶500 U/kg)为10.66%;蛹虫草纤溶酶给药低剂量组(8 U/kg)、中剂量组(12 U/kg)、高剂量组(18 U/kg)血栓湿重分别为78.0±41.7,61.3±18.3,(40.2±11.87) mg,血小板聚集率分别为12.53%,9.21%和7.66%,其效果与纤溶酶给药用量呈量效关系;丛珊滋[37]利用蛹虫草深层培养液,通过建立高血脂动物模型,来检验蛹虫草纤溶酶的抗脂能力。将小鼠随机分为正常对照组、尿激酶阳性对照组、高脂饲料组以及蛹虫草含纤溶酶培养液低、高剂量组五组,饲养8 d后,称质量、取血清,通过分析发现,与高血脂组相比,含纤溶酶的蛹虫草培养液可有效降低具有高血脂倾向动物血液中TC、TG和LDL-C的水平(p<0.01),同时可升高HDL-C水平(p<0.05)。含纤溶酶的蛹虫草培养液的高、低剂量组与高脂组相比较,可升高心脏、脾脏和肾脏指数,降低肝脏指数,其对心、脾、肾和肝脏具有一定保护作用。

评价一个新的具有生物活性的蛋白酶的功能特性,不仅要分析其直接的表观作用,更要综合评估未来的用药安全问题。结合目前对蛹虫草纤溶酶的生物活性研究,并与其他来源纤溶酶功效研究进行对比,今后可增加细胞毒性及毒理学实验,进一步明确其作为溶栓药物的可行性。同时,根据治疗血栓药物的机理差异,从抗凝方面入手,分析蛹虫草纤溶酶在抗凝血方面的功能性质,多方面评估蛹虫草纤溶酶的生物活性。

5 蛹虫草纤溶酶基因解析等相关领域研究

2011年Zheng等[38]发表了蛹虫草的全基因组序列,之后国内外研究者对蛹虫草的分子生物学方面研究才陆续展开,已有研究者对蛹虫草细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cox1)的Ⅰ型内含子[39]、蛹虫草SSU rDNA中Ⅰ型内含子[40]、蛹虫草组氨酸激酶基因(CmHK)[41]、虫草素代谢相关基因5′-nucleotidase部分序列[42]等进行分析,但对于蛹虫草纤溶酶的基因序列分析至今没有进展。大多数研究者仅仅是对纯化后的纤溶酶进行了部分N端序列分析[20,29],刘晓兰[43]对部分肽段进行了测序,七个肽段测序结果表明其和蛹虫草CM01的类胰蛋白酶丝氨酸蛋白酶序列具有100%的同源性,但并没有发现与现有的其他来源的具有纤维蛋白溶解活性蛋白酶的基因序列具有同源性。鉴于此,蛹虫草中纤溶酶的基因克隆、异源表达及晶体结构解析等研究工作尚留有较多空白,亟待展开进一步研究。

6 展望

蛹虫草作为一种宝贵的药食两用的传统药材，含有的活性成分具有对人体有益的作用,其含有的纤溶酶可作为一种新型绿色溶栓抗脂药剂替代品,具有很大的经济开发价值。鉴于其产地分布的局限性,目前国内外对蛹虫草的研究不够深入,随着人工养殖技术的发展,其研究开发主要集中在虫草素、虫草酸及虫草多糖的功能性研究,而对蛹虫草纤溶酶的研究甚少,停留在基本的分离纯化和酶学性质研究等方面,缺乏深入的挖掘。另外,由于产纤溶酶蛹虫草菌株种类的多样性,不同研究者分离纯化出的纤溶酶的酶学性质差异较大,对菌株性质做系统分类,并构建完整的数据库具有重要的意义。同时,现行的通用的测定纤溶酶活性的纤维蛋白平板法以市售尿激酶为标准测定标准曲线,具有直观简便的特点,但市售尿激酶性质及活性存在差别,且存在测定周期长、人为测量误差大等的特点使得检测到的酶活精确性较差,寻找一种简便快速准确的纤溶酶活性检测方法也是一个重要研究内容。此外,其携带的基因信息也尚不明确,还无法从分子水平进行更深入的比较分析,如何进一步挖掘蛹虫草纤溶酶的深层信息,深入提升蛹虫草纤溶酶应用潜力具有重要的学术价值和现实意义。

目前就蛹虫草纤溶酶现有的研究现状来看,其纤溶活性大小与其他来源的纤溶酶相比优势并不明显[44-45],但在溶栓抗脂效果方面具有比尿激酶更好的作用特点[29,36]。未来可期望通过分子改造进一步提高纤溶酶活性、明确蛹虫草纤溶酶产生机理、获得基因序列并进行表达、寻找特异性底物、增强溶栓抗脂效果及完善动物毒性实验等方面,研发出新的价格低廉特异性好的治疗血栓的药物或者开发预防高血脂的功能性食品配料及功能食品。

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ResearchprogressoffibrinolyticenzymefromCordycepsmilitaris

LIUYing-li,DINGLi,MAOHui-jia,WANGJing*,GONGLing-xiao

(Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health,Beijing Engineering and Technology Research Center of Food Additives,Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China)

Cordycepsmilitarisis a kind of traditional medicine and food fungus in our country,the fibrinolytic enzyme were found in recent years as a new kind of fibrinolytic enzyme. In this paper,the production condition,purification,enzyme properties,bioactivity and molecular biology of the fibrinolytic enzyme fromCordycepsmilitariswere summarized,providing a certain reference basis for future research and the possible research direction.

Cordycepsmilitaris;fibrinolytic enzyme;progress

2017-05-08

刘英丽(1981-)，女，博士，副教授，主要从事功能性食品配料研究，E-mail:liuyingli@th.btbu.edu.cn。

*

王静(1976-)，女，博士，教授，主要从事功能性食品配料研究，E-mail:wangjing@th.btbu.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31601564,31571940);北京市教委一般项目(SQKM201610011004);科技创新服务能力建设-科研水平提高定额-食品特色项目(科研类)(19005757057);北京市教委科研类专项科技创新平台(19008001226);北京市优秀人才培育资助青年拔尖团队项目。

TS201.1

A

1002-0306(2017)21-0314-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.21.061