两种清热解毒中成药对骨肉瘤MG63细胞增殖影响的比较研究

陈 鹏，林庆宾，刘 宇，伏 勇

(福建中医药大学骨伤学院， 福建 福州 350112)

两种清热解毒中成药对骨肉瘤MG63细胞增殖影响的比较研究

陈 鹏，林庆宾，刘 宇，伏 勇

(福建中医药大学骨伤学院， 福建 福州 350112)

目的探讨两种清热解毒中成药八宝丹、西黄丸对骨肉瘤MG63细胞增殖的影响。方法制备八宝丹、西黄丸水提物，干预骨肉瘤MG63细胞、用MTT法、平板克隆分别检测骨肉瘤MG63细胞增殖、克隆形成能力。结果MTT法检测高、中、低剂量组八宝丹对骨肉瘤MG63细胞增殖的抑制率分别为61.35%、40.25%、18.35%；高、中、低剂量组西黄丸对骨肉瘤MG63细胞增殖的抑制率分别为60.78%、40.60%、19.38%，组间同一浓度比较无显著性差异(P＞0.05)；各剂量组两种中成药均能抑制MG63细胞的克隆形成能力，但两组间同浓度无显著性差异(P＞0.05)。结论八宝丹、西黄丸均可抑制MG63细胞增殖和克隆形成能力，且两种中成药的抑制作用相比较无差异。

八宝丹；西黄丸；骨肉瘤；增殖；平板克隆

骨肉瘤好发于青少年，多发于四肢长骨干骺端。该病病情进展迅速，恶性程度高[1]。目前临床上主要以辅助化疗和外科根治性手术为主要治疗方法，患者的生命得以延长，但由于本病早期肺转移的发生率高，且骨肉瘤的增长率较快，导致其生存率较低。因此，采取各种治疗方法以抑制骨肉瘤的增殖促进其凋亡可以达到降低死亡率的目的。

现代临床上，八宝丹，西黄丸常用于乳腺癌、肠癌、肝癌、肺癌等疾病的治疗中，可以减轻病人痛苦、改善临床症状[2，3]。本研究以骨肉瘤MG63细胞作为研究对象，采用MTT法及平板克隆方法，观察八宝丹、西黄丸对骨肉瘤MG63细胞增殖的影响。

1 材料和方法

1.1 材料

八宝丹(厦门中药厂有限公司，生产批号：100603)；西黄丸(北京同仁堂科技发展股份有限公司制药厂，生产批号：13041014)；骨肉瘤MG63细胞(中国科学院上海生命科学院研究院细胞库提供)；RPMI-1640小牛血清(上海卡努生物科技有限公司)；DNM-9606酶标仪(美国英思科)；HTC-500恒温恒湿培养箱(上海三腾仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1溶液配制

①八宝丹水提物的制备配置前粉碎，研磨，用PBS溶解成每毫升药液含10mg生药，超声波超声30min后，高压后存放于4℃冰箱内备用。

②西黄丸水提物的制备方法同上。

1.2.2细胞培养

骨肉瘤MG63细胞在含10%小牛血清的RPMI-1640培养液贴壁生长，37℃、5%CO2条件下培养，每隔一天换液，按1∶3比例传代。

1.2.3 MTT实验

将培养好的细胞稀释成1.0×105个/ml，分种于96孔培养板，两种药物各设3个药物浓度，一个空白对照，每个浓度设5个复孔，每孔加100 μl骨肉瘤细胞悬液，培养箱中培养。根据生长曲线的结果，在接种72小时后换含药培养基，八宝丹浓度为2.5 mg/mL、5 mg/mL、7.5 mg/mL，西黄丸1 mg/mL、2 mg/mL、4 mg/mL，阴性对照组为加入0.1%DMSO和DMEM培养基，置37℃，5%CO2饱和湿度孵箱内培养。24小时后每孔加入5 mg/mL MTT各20 μl。继续培养4小时，吸去上清，加入150 μl的DMSO以溶解细胞内形成的结晶。在酶标仪上测定其在490 nm处的OD值。计算细胞在药物作用下的生长抑制率，即细胞毒性指数(CI)。CI(%)＝(1-实验组 OD值/阴性对照组 OD值) ×100%。

1.2.4平板克隆实验

取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化后加入培养液吹打均匀，接种于6孔板中，每孔加入500个细胞，37℃，5% CO2培养箱中培养24 h，细胞贴壁后药物组分别加入不同浓度的药物。每3 d更换一次培养液至细胞集落形成，终止培养。弃培养液，PBS液洗2次后，纯甲醇固定15 min，结晶紫染色30 min，空气干燥后，显微镜下计数形成的克隆数(≥50个细胞为一个克隆)，计算各组克隆形成率。克隆形成率＝克隆数/接种细胞数×100%。实验重复3次。

1.2.5统计学方法

所得数据均采用SPSS13.0统计软件进行处理，计量资料以s表示，组间比较采用单向方差分析(One-Way ANOVA)(F检验)。显著性水准取α＝0.05。。

2 结果

2.1 MTT实验结果

八宝丹高、中、低剂量组OD值分别为0.337±0.178、0.521±0.098、0.712±0.021，抑制率分别为 61.35%、40.25%、18.35%，其中高剂量组OD值与空白对照组(OD值＝0.872±0.024)比较有显著性差异(P＜0.01)、中、低剂量组OD值与空白对照组比较有差异(P＜0.05)；西黄丸高、中、低剂量组 OD值分别为0.342±0.015、0.518±0.122、0.703±0.103，抑制率分别为60.78%、40.60%、19.38%，其中高剂量组OD值与空白对照组比较有显著性差异(P＜0.01)、中、低剂量组OD值与空白对照组比较有差异(P＜0.05)；八宝丹、西黄丸各浓度组间比较无差异(P＞0.05)。

2.2 平板克隆实验结果

八宝丹、西黄丸各剂量组八宝丹高、中、低剂量组细胞克隆数分别为 101.7±3.335、122.7±6.751、152.5± 3.852，其中高剂量组细胞克隆数与空白对照组(细胞克隆数＝182.2±7.363)比较有显著性差异(P＜0.01)，中、低剂量组细胞克隆数与空白对照组比较有差异(P＜0.05)；西黄丸高、中、低剂量组细胞克隆数分别为 106.2±1.351、120.6±4.225、148.3±8.267，其中高剂量组细胞克隆数与空白对照组比较有显著性差异(P＜0.01)，中、低剂量组细胞克隆数与空白对照组比较有差异(P＜0.05)，两种药物均能抑制骨肉瘤MG63细胞的克隆形成能力；两组药物各浓度组间比较无统计学差异(P＞0.05)。

3 讨论

中医学理论认为：骨肉瘤是正气亏虚、邪毒内侵凝聚而成。究其病机，主要是气滞而导致血瘀内停，至于湿热、风寒、痰浊均是促成气滞血瘀的间接因素。在骨肉瘤的治疗中应注重活血化瘀、扶正固本、化痰散结、清热解毒，八宝丹由天然牛黄、天然麝香、蛇胆、三七、珍珠粉等组成。西黄丸由牛黄、麝香、乳香(醋制)、没药(醋制)组成。二药均具有清热解毒、消肿止痛、削坚化结之功效。吴豪等[4]研究发现八宝丹对荷瘤小鼠外周血、脾脏及骨髓中的MDSC比例有明显降低作用。周忠等[5]研究发现八宝丹体外对骨肉瘤U-2OS细胞有抑制增殖和诱导凋亡作用。金沈锐等[6]通过体内体外两方面实验，得出西黄丸可特异性地将肿瘤细胞阻滞在G2-M期，提示西黄丸可通过影响肿瘤细胞周期来发挥抑瘤效应。现代药理研究表明，牛黄、三七等清热解毒药物具有较广的抗菌谱，能抑制病毒、提高机体的非特异性免疫功能[7-8]；麝香具有抗菌、增强免疫及抗肿瘤等作用；制乳香、制没药等活血化瘀药物可以改善结缔组织代谢及微循环，抑制肿瘤细胞株的增值[9-10]。

本次研究发现，两种抗肿瘤中成药体外对骨肉瘤MG63细胞产生影响，均能抑制骨肉瘤MG63细胞的增殖及克隆形成能力，有一定的浓度依赖性。不仅符合中医治疗骨肉瘤的治则，体现了中医治疗肿瘤的特点和优势，亦具有基础实验为其佐证。然而，由于中药复方抗肿瘤多靶点效应，骨肉瘤MG63细胞的增殖受多种因素协同调控，如基因、细胞因子及信号通路等，因此，有必要进一步研究两种药物在其他途径是否同样对骨肉瘤细胞的增殖能力产生影响。

[1] 周 忠，林建华.骨肉瘤中西医结合治疗研究进展[J].甘肃中医.2009；19(3)：6-9

[2] 李洪伦，刘瑾瑜，等.八宝丹在恶性肿瘤治疗中的应用探索[J].2016；39(5)：383-385

[3] 徐秋萍，胡文静，刘宝瑞.西黄丸抗肿瘤作用的研究现状[J]. 2016；14(1)：32-35

[4] 吴 皓，李 鸿，祁 鑫，等.八宝丹对结肠癌荷瘤小鼠的血、脾和骨髓中的髓系抑制性细胞的影响[J].2014；29(2)：568-570

[5] 周 忠，林建华.八宝丹对骨肉瘤细胞U-2OS的抑制增殖和诱导凋亡实验研究[J].中国中医骨伤科杂志，2006，14(1)：93-95

[6] 金沈锐，祝彼得，秦旭华，等.西黄丸对人肝癌细胞SMMC7721及小鼠宫颈癌细胞 U14周期的影响[J].2007，18(11)：2782-2783

[7] 张宇静，夏 晶，仇佳思，等.牛黄中胆汁酸的药理作用及定量分析方法研究进展[J].国际药学研究杂志，2016，43(2)：268-274.

本文编辑：罗 兰

R451

B

ISSN.2095-8242.2017.12.2316.02

福建中医药大学校管科研课题项目(X2015003-平台、X2015001-平台)。