枸杞多糖改善糖尿病肾病作用的研究

赵蕊，王春仁，黄玉兰，贾桂燕

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.哈尔滨医科大学基础医学院）

枸杞多糖改善糖尿病肾病作用的研究

赵蕊1，2，王春仁1，黄玉兰1，贾桂燕1

（1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院，大庆 163319；2.哈尔滨医科大学基础医学院）

应用2型糖尿病小鼠模型，观察中药活性成分枸杞多糖（LBP）对2型糖尿病小鼠肾脏的保护作用。免疫组化半定量法检测各组小鼠肾组织PPAR-γ蛋白的表达，并通过Western blot检测LBP对2型糖尿病小鼠肾组织中的p38MAPK表达的影响，初步探讨LBP改善糖尿病肾病（DN）的可能作用机制。实验结果表明，与正常对照组比较，2型糖尿病小鼠肾组织PPAR-γ蛋白含量降低，LBP作用4 w后，能上调2型糖尿病小鼠肾组织PPAR-γ蛋白含量，且还能对高糖引起的肾组织p38MAPK活性增加表现出明显的对抗作用。总之，LBP对2型糖尿病小鼠肾组织具有保护作用，且与上调PPAR-γ蛋白表达有关。

枸杞多糖；糖尿病肾病；PPAR-γ；p38MAPK

糖尿病肾病（DN）的主要病因是由于糖代谢异常所致的肾小球硬化，并伴有尿蛋白含量增高，是2型糖尿病中最常见的并发症之一。西医药尚无安全有效的治疗手段。而中医药可从整体水平对DN进行综合调理，因此，研究开发高效低毒的治疗DN的药物，对于延长患者的寿命，提高生活质量具有重大的意义。枸杞子是我国药食两用的名贵中药材，枸杞多糖（LBP）是枸杞子中的主要活性成分，具有广泛的药理作用。研究表明，过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）-γ与DN的发病有密切的关系，上调PPAR-γ蛋白水平可明显改善DN小鼠肾脏的损伤[1]。血糖持续升高可激活p38MAPK的信号转导通路，导致DN的发生、发展。p38MAPK是细胞信号传导的交汇点[2]，但它在DN发病中的作用机制以及它与PPAR-γ关联的研究国内外尚未见报道。研究应用2型糖尿病小鼠模型，观察LBP对2型糖尿病小鼠肾脏的保护作用，并通过检测LBP对2型糖尿病小鼠肾组织中的PPAR-γ和p38MAPK表达的影响，初步探讨LBP改善DN的可能机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

选取4周龄，体重20±2 g的SPF级昆明小鼠（购于长春白求恩医科大学实验动物中心）。

1.2 主要试剂

尿微量白蛋白试剂盒、肌酐试剂盒、尿素氮试剂盒（北京晶美生物技术有限公司）；PPAR-γ和Phospho-p38MAPK单克隆抗体（Santa Cruz Biotechnology公司）；SP免疫组化染色试剂盒和DAB显色试剂盒（北京晶美生物技术有限公司）；ECL显色试剂盒（Santa Cruz Biotechnology公司）。

1.3 实验方法

1.3.1 枸杞多糖制备

宁夏枸杞子烘干粉碎，氯仿：甲醇（2∶1）回流脱脂、脱色处理。用80%的乙醇脱小分子糖后于80℃下进行水提，提取3次，合并滤液，减压蒸馏浓缩，置于95%的乙醇中过夜，离心。获得的沉淀分别用95%的乙醇、无水乙醇、丙酮脱水，最后经真空干燥得LBP。

1.3.2 型糖尿病小鼠模型的建立与分组

小鼠随机分为正常组和造模组。正常组给予普通饲料喂养。造模组小鼠先给予高糖高脂饮食4 w，再行一次性腹腔注射0.5%的链脲佐菌素（STZ，现用现配，60 mg·kg-1），3 d后用京都血糖仪空腹测血糖。模型成功的小鼠（血糖浓度＞11.1 mmol·L-1）再随机分为模型对照组、LBP（200 mg·kg-1）组和罗格列酮组（3 mg·kg-1），按照每10 g小鼠体重0.2 mL持续灌胃4 w，正常对照组和模型对照组给予同等剂量的生理盐水。

1.3.3 尿微量白蛋白检测及生化分析

各组小鼠给药4 w后，收集24 h尿液，离心，ELISA法测量尿微量白蛋白（Urinary albumin）。摘眼球取血，分离血清，全自动生化分析仪检测尿素氮（BUN）和血肌酐（Scr）水平。小鼠处死后取肾脏，称重，计算肾指数（肾重/体重（%））。取其中部分肾组织用于HE染色及免疫组化分析，另取一部分肾皮质迅速置于液氮中用作蛋白提取。

1.3.4 病理学检查

取适量肾组织在4%中性多聚甲醛中固定，脱水、透明及石蜡包埋制片等处理，5 μm厚度切片。HE常规染色，中性树胶封片。光镜观察，记录病理形态学变化。

1.3.5 免疫组化法检测PPAR-γ在蛋白水平的表达

免疫组化半定量分析各组小鼠肾组织中PPAR-γ蛋白的表达水平。结果观察：每组6张切片，随机选取20个视野，根据染色强度和面积计算阳性细胞占视野内细胞数的比例并计分，具体评分为：阳性细胞数占总细胞数低于25%的为（+/-），25%～50%为（+），51%～75%为（++），超过75%的为（+++），且计为1、2、3、4分；染色强度分别以（+/-）、（+）、（++）表示，计为1、2、3分；二者分数乘积作为免疫组化结果。

1.3.6 各组小鼠肾皮质磷酸化p38 MAPK的检测

称取100 mg肾皮质，用组织裂解液裂解后匀浆用超声细胞粉碎仪超声，离心取上清，BCA法测定蛋白浓度。定量后取各组标本经SDS-PAGE电泳分离后湿法转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h。加入相应的稀释一抗，4℃孵育过夜。洗膜后加辣根过氧化物酶标记的二抗，室温孵育1 h，ECL试剂盒进行显影，凝胶成像系统采集成像。Western blot检测条带用凝胶成像仪分析系统Quantity One软件扫描灰度值。计算目的蛋白与β-actin灰度值的比值，进行统计学分析。

1.3.7 数据分析

所有的数据采用SPSS 19.0统计软件进行数据处理分析，两组资料的比较采用两样本均数比较的t检验。多组间样本比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 LBP对2型糖尿病小鼠肾功能的影响

为了研究枸杞多糖对2型糖尿病小鼠肾脏的保护作用，首先检测造模后LBP处理4 w对2型糖尿病小鼠肾功能的影响，表1结果显示，与正常对照组相比，STZ诱导的模型对照组小鼠的BUN、尿微量白蛋白、Scr、肾重/体重比值水平均增高（P＜0.01）。LBP灌胃4 w后，上述肾功能指标均有降低，差异有统计学意义（P＜0.01），LBP给药组与罗格列酮组差异无统计学差异（P＞0.05）。实验结果表明LBP可以减轻2型糖尿病小鼠的肾损伤。

2.2 各组小鼠肾脏组织的HE染色结果观察

为进一步观察LBP改善2型糖尿病小鼠的肾损伤，实验从形态学角度做了进一步分析。各组小鼠肾组织HE染色切片观察发现，正常小鼠肾小球大小适中，结构完整，肾小管形态正常，无炎症细胞浸润和纤维组织增生。2型糖尿病小鼠肾小球体积增大，肾小管结构模糊。LBP和罗格列酮作用4 w后，光镜下观察小鼠肾小球结构基本恢复正常，结果显示如图1。

表1 LBP对2型糖尿病小鼠肾功能的影响Table 1Effect of LBP on renal function in type 2 diabetic mice

图1 肾组织形态学变化（HE×400）Fig.1Morphological changes of kidney tissue（HE×400）

2.3 免疫组化分析小鼠肾组织PPAR-γ蛋白表达

为了探讨枸杞多糖改善DN的可能机制，检测肾病相关蛋白PPAR-γ的表达。图2显示各组小鼠肾组织PPAR-γ免疫组化染色结果。显微镜下显示PPAR-γ阳性表达为棕黄色，根据染色强度和面积进行半定量分析显色结果。表2结果统计了各组小鼠肾组织PPAR-γ蛋白的表达含量。正常组小鼠肾组织PPAR-γ高表达，但是模型组PPAR-γ表达降低，与正常组相比差异有统计学意义（P＜0.01），与模型组比较，LBP和罗格列酮组PPAR-γ表达明显增加，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.4 Western bIot法检测磷酸化p38MAPK蛋白表达

最后，通过分析磷酸化p38MAPK蛋白的表达水平，进一步研究LBP改善DN的可能机制。图3显示Western blot法检测各组小鼠肾皮质p38MAPK蛋白表达情况。结果显示，与正常对照组比较，模型对照组p38MAPK蛋白表达量明显增多；与模型对照组相比，LBP和罗格列酮两组小鼠肾皮质的p38MAPK表达量降低。

图2 PPAR-γ蛋白在各组小鼠肾脏中的表达（×400）Fig.2The protein expression of PPAR-γ in kidneys of mice（×400）

表2 LBP对2型糖尿病小鼠肾组织PPAR-γ表达的影响Table 2Effect of LBP on the expression of PPAR-γ in kidney of in type 2 diabetic mice

图3 LBP对2型糖尿病小鼠肾皮质p38MAPK蛋白表达的影响Fig.3Effect of LBP on the expression of p38MAPK in renal cortex of type 2 diabetic mice

3 讨论

糖尿病性肾病是糖尿病引起的严重和危害性最大的一种慢性并发症，亦是糖尿病患者致死的主要原因之一。肾脏肥大，肾小球滤过功能异常和微量蛋白尿是本症的主要特点[3]。研究结果显示，小鼠经高糖高脂饮食诱导，结合腹腔注射STZ造模后，2型糖尿病小鼠的尿素氮、血肌酐和尿微量白蛋白水平较正常小鼠均有显著增加，肾重/体重指数明显上升，说明2型糖尿病模型小鼠机体存在肾脏损伤，发生了肾病并发症。课题组的前期研究结果证明LBP有很好的降糖活性，且能够增加2型糖尿病大鼠的胰岛素敏感性[4]，但其改善DN的活性及作用机制目前尚未完全阐明。实验旨在通过观察LBP对2型糖尿病小鼠的肾脏保护作用，探讨其改善DN的作用及机制，为进一步研究LBP的临床应用提供一定的理论依据和实验支持。实验结果证实，经LBP处理4 w后，肾功能等生化指标得到改善（见表1）。表明LBP对糖尿病肾病具有一定的治疗作用。

胰岛素增敏剂噻唑烷二酮（TZDs）是临床治疗2型糖尿病和糖尿病肾脏并发症常用的药物，TZDs是PPAR-γ的配体，也是PPAR-γ的激动剂。而罗格列酮是TZDs的一种[5]。研究表明PPAR-γ在维持正常肾脏功能上起到重要作用，PPAR-γ的高表达与防治DN的发生有密切关系[6]。实验结果显示，PPAR-γ蛋白在正常组小鼠肾组织中呈现功能性表达，但是PPAR-γ蛋白的表达在2型糖尿病性肾病小鼠却明显降低，实验经LBP和罗格列酮灌胃给药4 w后，小鼠肾脏病理形态学异常得到改善，且与模型组小鼠相比，肾组织PPAR-γ蛋白表达增加，这提示LBP可能发挥了PPAR-γ的特异性配体作用，通过与PPAR-γ结合，进而影响了与胰岛素效应相关的某些基因的表达，最终改善2型糖尿病小鼠的肾功能。在DN的发展过程中，炎症相关信号通路-p38丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路与肾组织损伤密切相关[7]。研究显示，持续高血糖能激活p38MAPK通路，进而发挥其相应的生物学功能[8]，如P38 MAPK在高血糖所致的内皮通透性增高中起着主要的信号转导作用[9]。高血糖可以使P38MAPK磷酸化，活性明显升高，活化的P38MAPK作用于底物MAPKAP-K2/K3，后者则使热休克蛋白-27（HSP-27）磷酸化。试验研究结果显示，给予LBP和罗格列酮灌胃4 w后，2型糖尿病小鼠肾组织的p38MAPK表达显著减少。由此可见，LBP对持续高血糖引起的肾组织p38MAPK活性增加表现出明显的抑制作用。

4 结论

LBP对2型糖尿病小鼠损伤的肾脏具有改善作用，其机制可能与LBP抑制p38MAPK蛋白表达水平，激活2型糖尿病小鼠肾组织PPAR-γ有关。

［1］Gao D，Li Q，Gao Z，et al.Antidiabetic effects of Corni Fructus extract in streptozotocin_induced diabetic rats［J］. Yonsei Med J，2012，53（4）：691-700.

［2］Fujita H，Omori S，Ishikura K，et al.ERK and p38 mediate high-glucose-induced hypertrophy and TGF-beta expression in tubular cells［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2004，286（1）：120-126.

［3］周强，仝小林，刘桂芳，等.糖尿病肾病的中医临床治疗概况［J］.中医药信息，2011，29（1）：95-97.

［4］Zhao R，Li Q W，Xiao B.Effect of Lycium barbarum polysaccharide on the improvement of insulin resistance in NIDDM rats［J］.Yakugaku Zasshi，2005，125（12）：981-988.

［5］Rane M J，Song Y，Jin S，et a1.Interplay between Akt and p38MAPK pathways in the regulation of renal tubular cell apoptosis associated with diabetic nephropathy［J］.Am J Physiol Renal Physiol，2010，298（1）：49-61.

［6］Wang F F，Mullican S E，Dispirito J R，et al.Lipoatrophy and severe metabolic disturbance in mice with fat-specific deletion of PPAR-γ［J］.Proc Nati Acad Sci，2013，110（46）：18656-18661.

［7］Zhang R，ZhouS J，Li C J，et al.C-reactive protein/oxidised low-density lipoprotein/β2-glycoprotein I complex promotes atherosclerosis in diabetic BALB/c mice via p38mitogen-activated protein kinase signal pathway［J］.Lipids Health Dis，2013，26（12）：42.

［8］王健楠，阮洪生，崔玉东，等.身痛逐瘀汤通过调控P38 MAPK信号通路抑制LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞一氧化氮的分泌［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2015，27（3）：75-78.

［9］Mima A，Kitada M，Geraldes P，et al.Glomerular VEGF resistance induced by PKCδ/SHP-1 activation and contribution to diabetic nephropathy［J］.FASEB J，2012，26（7）：2963-2974.

Study of Lycium Barbarum.Polysaccharide on Diabetic Nephropathy

Zhao Rui1，2，Wang Chunren1，Huang Yulan1，Jia Guiyan1
（1.College of Life Science and Technology，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319；2.Basic Medical Science College，Harbin Medical University）

The protective effect of Lycium barbarum.polysaccharides（LBP）was observed in kidney of type 2 diabetic mice model.To explore the possible mechanisms of LBP on diabetic nephropathy（DN），the protein expression of PPAR-γ in kidney was tested by immunohistochemical method，and the p38MAPK expression was detected through the Western blot.The results showed that the protein expression of PPAR-γ in kidney was decreased compared with control group.After 4 w treatment，the protein level of PPAR-γ in kidney increased，and LBP also showed the obvious antagonism on p38MAPK in kidney tissues by high sugar.In a word，LBP had a protective effect in kidney of type 2 diabetic mice by improving the protein level of PPAR-γ signaling pathway.

Lycium barbarum；polysaccharides；diabetic nephropathy；PPAR-γ；p38MAPK

R285

A

1002-2090（2017）01-0089-05

2016-05-15

LBP择时给药逆转小鼠胰岛素抵抗的昼夜节律机制（2014M551281）。

赵蕊（1975-），女，副教授，燕山大学毕业，现主要从事新药研究与开发方面的研究工作。