植物乳杆菌粉发酵玉米秸秆条件优化

郭佳奇，王瑞瑞，刘清双，张培培，杨丽娟

（黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319）

植物乳杆菌粉发酵玉米秸秆条件优化

郭佳奇，王瑞瑞，刘清双，张培培，杨丽娟

（黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319）

以植物乳杆菌为实验菌种并进行冻干处理，将冻干菌粉加入玉米秸秆中进行青贮发酵，以粗蛋白为指标对发酵结果进行判定。以单因素实验结果发酵时间10 d，发酵温度30℃，接种量1%为基础进行响应面分析确定最优发酵条件，通过实验测得优化后的粗蛋白含量为11.71%，与预测值11.85%非常接近。

植物乳杆菌；农作物废弃物；响应面

我国是农业大国，农作物废弃物产量巨大，目前对于秸秆等农作物的利用主要以加工青贮饲料为主[1]。将乳酸菌加入到青贮饲料中可以显著提高其乳酸的含量以及营养价值[2]。植物乳杆菌是农作物秸秆发酵的重要菌种，其冻干菌粉可以直接应用于秸秆发酵，和液态菌种相比此种菌粉便于保存，质量稳定，用法简单适用于家庭及不同规模的工业化生产。旨在研制一种高活性冻干菌粉及应用工艺，为农作物废弃物发酵青贮饲料的生产应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

脱脂乳、维生素C、甘油、干玉米秸秆、植物乳杆菌（本实验室保藏）[3-5]

1.2 生产工艺

1.3 试验方法

秸秆发酵液制备；筛选玉米秸秆，颜色白中带黄，无腐败和霉变。秸秆切成长度1～2 cm的小段，将茎秆和叶子碎片混合均匀，并放入陶瓷发酵缸中（5 kg·缸-1），加水（5 L·缸-1），按实验设计加入相应比例的冻干菌粉制备秸秆发酵液。

1.3.1 冻干菌剂制备

1.3.1.1 菌体的培养及收集

植物乳杆菌37℃条件下在MRS液体培养基中培养48 h，再以4 000 r·min-1的条件将菌液离心20 min[7]。1.3.1.2复合保护剂制备

维生素C采用膜孔径为0.22 μm的滤菌器除菌[8-9]，脱脂乳在115℃下保温15 min杀菌，纯甘油121℃，15 min灭菌。按比例配置复合保护剂，即脱脂乳∶甘油：Vc=13.68%∶1.97%：0.20%[10]。

1.3.1.3 保护剂添加

将菌体离心后加入10 mL复合保护剂，将保护剂含菌量调整至1010cfu·mL-1[11]。

1.3.1.4 制备植物乳杆菌粉

1 mL植物乳杆菌菌悬液分装进无菌带塞的玻璃瓶中，超低温冰箱中-40℃下预冻8 h，真空冻干机中1 Pa，-45℃下干燥24 h[12]，-5℃低温冰箱中保存备用。

1.3.2 玉米秸秆发酵单因素试验

1.3.2.1 不同发酵时间对发酵秸秆中粗蛋白含量的影响

将植物乳杆菌冻干菌粉以质量比0.5%接种量直接加入秸秆发酵液中，30℃密封培养，每间隔5 d测 1次发酵秸秆的蛋白质含量。

1.3.2.2 不同发酵温度对发酵秸秆中粗蛋白含量的影响

将植物乳杆菌冻干菌粉以质量比0.5%的接种量直接加入秸秆发酵液中，发酵液温度设置为0～60℃7个梯度，在发酵10 d时分别测定7组陶瓷发酵缸中发酵液的蛋白质含量，确定最佳发酵温度。

1.3.2.3 不同接种量对发酵秸秆中粗蛋白含量的影响

将发酵温度设定为30℃，分别以质量比0.5%～3.5%7个梯度的接种量向发酵液中直接加入植物乳杆菌冻干菌粉，发酵10 d时测定发酵秸秆粗蛋白含量，从而确定最佳接种量。

1.3.3 响应面试验确定最佳发酵条件

在单因素试验结果的基础上，进一步对发酵时间、发酵温度和接种量进行优化。以发酵时间、发酵温度和接种量为自变量，以发酵液中粗蛋白含量为响应值，设计中心组合试验[13-14]。

表1 响应面试验中各因素的设定Table 1Factors of the response surface test

1.4 测定方法

1.4.1 冻干菌粉复水处理

向冷冻干燥后的菌粉中加入与冷冻干燥前等体积的无菌水，水浴锅中30℃振荡融化10 min，制备成菌悬液[15]。

1.4.2 冻干菌粉存活率及含菌量的测定

菌粉存活率测定方法：采用平板菌落计数法于分别测定冷冻干燥前后活菌数量，计算存活率。培养条件为37℃培养48 h。

冻干菌粉含菌量（cfu·g-1）=冻干菌粉存活率× 1010（cfu·mL-1）×10 mL/冻干后菌粉质量（g）

1.4.3 发酵秸秆中粗蛋白含量的测定方法

粗蛋白（CP）用GB64322-86法[16]

2 结果与分析

2.1 发酵时间对秸秆发酵过程中粗蛋白含量的影响

按实验设计在不同的时间点对发酵液中粗蛋白含量进行测定，结果显示随着发酵时间的增加发酵秸秆中粗蛋白含量先上升后下降，发酵到10 d时，粗蛋白含量达到最大值。随着发酵时间延长，粗蛋白含量有所下降。

图1 不同时间对发酵液中粗蛋白含量的影响Fig.1Effect of the different fermentation time on the content of crude protein

2.2 发酵温度对秸秆发酵过程中粗蛋白含量的影响

以植物乳杆菌冻干菌粉为试验材料，实验结果显示，随着温度的增加，粗蛋白含量随温度的改变有明显变化，当发酵温度为30℃时，发酵液中粗蛋白含量达到最大值。随着发酵温度的升高，植物乳杆菌活性提高，发酵液中粗蛋白含量升高，而过高的发酵温度易使菌体失活，所以粗蛋白含量呈先升后降的趋势。试验结果显示30℃为较佳发酵温度。

图2 发酵温度对粗蛋白含量的影响Fig.2Effect of the fermentation temperature on the content of crude protein

2.3 接种量对秸秆发酵过程中粗蛋白含量的影响

以植物乳杆菌冻干菌粉为试验材料，实验结果显示，随着接种量的不断增加发酵秸秆中粗蛋白的含量先升后降，由图可知当接种量为1%时，发酵秸秆的粗蛋白含量达到最大值。

图3 接种量对蛋白质含量的影响Fig.3Effect of the inoculation amount on the content of crude protein

2.4 响应面实验优化最佳保护剂配比

以单因素试验的最佳值为响应面实验的中心点。响应面试验的各水平值及试验结果如表1和表2所示。

表2 响应面试验设计及结果Table 2Results of the response surface test

以粗蛋白含量Y1为因变量，因素X1，X2，X3为自变量的回归方程为：

Y1=11.922 32-2.228 803*X1X1-0.849 943*X2X2-0.761 555*X3X3

用F检验评价方程，得到概率水平在99%的条件下回归是显著的（P＜0.000 134）。方程的确定系数R2=92.79%，说明这个方程可以解释92.79%的试验数据。图1～3是方程的响应面图，证实了拟合面有真实的最大值。

软件计算结果为，接种量1.0062%，时间10.3156d，温度30.359 5℃时，发酵秸秆的粗蛋白最大含量为11.85%。为了对预测结果进行验证，在这个点做重复实验，通过3次实验求得平均值，发酵秸秆粗蛋白平均含量为11.71%。与试验模型预测得到的粗蛋白含量最大值吻合，说明优化得到的响应面模型与实验数据拟合的较好。

图4 发酵时间与发酵温度交互作用对粗蛋白含量的影响的响应面图Fig.4The response surface graph of the effect of the interactions between time and temperature on the content of crude protein

3 结论

采用添加微生物制剂加青贮饲料，提高了玉米秸秆粗饲料的使用量和利用率，节约饲料粮，解决了人畜争粮矛盾。采用冷冻干燥后的乳酸菌粉发酵秸秆，操作简便，适用于不同的发酵规模。发酵玉米秸秆中粗蛋白的含量是评价发酵产物营养价值的主要指标[17]。以粗蛋白为评价指标对玉米秸秆发酵条件进行优化，找到最佳发酵组合，提高农作物废弃物的利用率。王汝富曾用发酵活干菌处理秸秆，其粗蛋白质含量提高2.4%，饲喂肉牛日增重提高73.5%[18]。刘圈炜等[19]在青贮玉米秸秆中添加复合乳酸菌制剂，试验组乳酸含量和蛋白质含量均显著提高。试验采用植物乳杆菌粉发酵玉米秸秆并对发酵条件进行优化，优化得到的最佳发酵条件为接种量为1.006 2%，时间为10.315 6天，温度为30.359 5℃时，得到最大蛋白质含量11.71%。试验结果与武安泉[20]得出的最优发酵温度20℃有较大差异，分析原因可能是由于所用菌种不同以及试验才采用冻干菌粉需要较高温度提高菌体活性所致。

图5 发酵时间与接种量交互作用对粗蛋白含量的影响的响应面图Fig.5The response surface graph of the effect of the interactions between time and inoculation amount on the content of crude protein

图6 发酵温度与接种量交互作用对蛋白质含量的影响的响应面图Fig.6The response surface graph of the effect of the interactions between fermentation temperature and inoculation amount on the content of crude protein

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Optimization of Fermentation Condition for Maize Straw by Lactobacillus Plantarum

Guo Jiaqi，Wang Ruirui，Liu Qingshuang，Zhang Peipei，Yang Lijuan
（College of Agronomy，Heilongjiang Bayi Agricultural University，Daqing 163319）

Lactobacillus plantarum was used as experiment strains and the freeze-drying powder was added to maize straw for silage fermentation，the content of crude protein was tested as an indicator to determine the fermentation results.In univariate results fermentation time 10 d，fermentation temperature 30℃，inoculation 1%as the basis to response surface analysis for determining optimum fermentation conditions，as measured by the protein content of experimental optimized for 11.71%，very close to predicted value 11.85%.

Lactobacillus plantarum；agricultural waste；response surface

S816.53

A

1002-2090（2017）01-0017-05

2015-06-18

资金项目：黑龙江八一农垦大学大学生创新创业训练项目（xc2014072）。

郭佳奇（1995-），女，黑龙江八一农垦大学农学院环境科学专业2013级本科生。

杨丽娟，女，实验师，E-mail：591287113@qq.com。