Foxl2基因对小鼠软骨及骨发育的调控研究

薛建利

(西安交通大学第二附属医院骨三科，陕西 西安 710004)

Foxl2基因对小鼠软骨及骨发育的调控研究

薛建利

(西安交通大学第二附属医院骨三科，陕西 西安 710004)

目的 Foxl2转录因子单倍剂量不足会导致小睑裂综合征(blepharophimosis ptosis epicanthus inversus syndrome，BPES)，表现为眼睑异常和卵巢功能早衰。小鼠Foxl2基因缺乏亦导致眼睑、额头缺陷和雌性性腺发育不全。本试验旨在研究Foxl2缺乏对小鼠出生后的生长和胚胎期骨、软骨形成的影响。方法 对比雄性Foxl2-/-与野生型小鼠在不同发育阶段的特征，测量绘制生长曲线。骨骼用阿尔新兰/茜素红、硝酸银染色，行免疫荧光分析和共聚焦显微镜下分析。RT-qPCR分析生长激素(growth hormone，GH)/胰岛素样生长因子1(insulin like grouth factor-1，IGF1)通路以评估下丘脑-垂体-骨轴上标记物的表达。结果 较之野生型小鼠，Foxl2敲除小鼠表现出较小体型、骨骼异常、软骨和骨矿化缺陷、GH/IGF1轴下调。结论 Foxl2是生长发育、软骨和骨形成的过程的主要转录因子。

Foxl2；骨发育；软骨发育；小鼠

Foxl2基因位于细胞核内，是一个2.7 kb的单外显子基因，位于3q23区域，其编码蛋白质属于forkhead转录因子家族，由376个氨基酸组成，包含一个由100个氨基酸构成的forkhead DNA结合区和一个多聚丙氨酸区[1]。Foxl2 (MIM # 605597)变异最初发现于一种常染色体显性遗传病[2]，小睑裂综合症(blepharophimosis ptosis epicanthus inversus syndrome，BPES，MIM # 110100)，表现为眼睑、前额异常和卵巢功能障碍所致原发性卵巢功能不全。Foxl2基因也被证实的在卵巢功能维持方面发挥重要作用[3]，是卵巢发育中的一种早期调节因子，Foxl2基因突变导致其编码的蛋白质在聚丙氨酸区域前有截断则发生BPES I型的风险高，可致女性患者不育，原发性闭经或提前绝经；若基因突变引起聚丙氨酸区域扩增可导致BPES Ⅱ型，男女皆可生育。有些病例还存在其他的异常，如智力低下、发育迟缓、心脏缺损、小头及突出耳等。Foxl2-/-小鼠呈现的颅面部和性腺特征类似于人BPES，包括两性眼睑异常、卵泡发育不全所致雌性不育、睾丸决定基因上调(Sox9、Fgf9、Wt1、Gata4、Dhh、Sf1、Dmrt1和Fgfr2)和局部性反转[4-6]。野生型小鼠交配后14.5 dpc，Foxl2即开始在卵巢颗粒细胞中表达。但敲除小鼠folxl2基因后可出现更多表型，如两性体型减小，血浆胰岛素样生长因子1(insulin like grouth factor-1，IGF1)水平可降低60%。研究证实，Foxl2在垂体促性腺细胞(11.5 dpc)[7]、成人垂体促甲状腺和促性腺细胞也有表达[8]，但foxl2基因缺失对体型及发育的影响机制尚无相关研究报道。

已有文献报道Foxl2在眼睑和卵巢发育中的作用，本试验拟探索Foxl2对生长发育和头面部、骨骼发育的影响，通过构建Foxl2-/-小鼠，对比雄性Foxl2-/-与野生型小鼠在不同发育阶段的特征，研究foxl2基因缺失影响激素水平和生长发育的可能机制。

1 资料与方法

1.1 实验动物建立 利用Cre/Loxp技术敲除小鼠促性腺组织中的FOXL2，建立Foxl2-/-小鼠[9]，实验小鼠常规安置于温度20～24℃、湿度50%～60%、12 h光暗循环的环境中，水、食物可自由获取。小鼠通过二氧化碳窒息法处死。利用PCR基因分型方法检测、验证野生型和突变小鼠的FOXL2基因(公用引物b：GGATCTCTGAGTGCCAACGC，野生型序列识别引物a：CACGGGAAAGCAGAGGCCGC或c：CACACTGCTCGACATTGGGTG)。

1.2 生长曲线测绘 利用卡尺和分析天平分别测量同窝出生的三种雄性小鼠(WT、Foxl2+/-和Foxl2-/-)的身长、体重，分别于小鼠出生后0～100 d内测量，每周3次，每次时间点相同。用GraphPad 6软件进行生长曲线绘制、回归分析和特异性生长速率计算，标准t检验用于检验组内测量值的显著性意义。

1.3 骨骼染色和影像学分析 新生、成年小鼠的骨骼用进行茜素红/阿尔新兰染色[10]，小鼠窒息致死后，使用Faxitron X-Ray机器进行X线摄像，观察分析骨骼情况[11]。

1.4 组织学分析[4]取不同发育阶段的胚胎(12.5 dpc，13.5 dpc，14.5 dpc，15.5 dpc，16.5 dpc)，在室温下用Histochoice(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，USA)固定液固定4～6 h，进行石蜡包埋、5μm连续切片。利用PCR反应扩增Y染色体性别决定区域(Sry)，仅选取雄性胚胎(SryF 5′-GTGGTGAGAGGCACAAGT-3′；SryR 5′-CTGTGTAGGATCTTCAATC-3′)。将切片先后行阿尔新兰/茜素红染色、硝酸银染色，置于3%双氧水中处理1 h，用1×柠檬酸盐缓冲液和0.01 M EDTA(pH 8)洗涤，封闭液(Protein Block Serum-free，×0909，Dako，Glostrup，Denmar)室温下封闭30 min，一抗4℃孵化过夜，再行免疫荧光检测。相关抗体：1︰50兔抗-Foxl2(Eurogentec s.a.)，1︰500山羊抗兔IgG(H+L)(Alexa Fluor 488)。Leica DMIRE激光共聚焦显微镜采集图像。

1.5 RT-qPCR分析 按RT-qPCR步骤，利用Trizol法抽提RNA，反转录获得cDNA，将Gapdh设为内部参照，分析Foxl2表达情况。反转录前利用荧光绿实时定量PCR分析三个生物学样本(野生型，P0和P7 Foxl2-/-)的RNAs，检测Ghrh，Ghrh-r，Gh，Igf1基因，内部参照基因为β-actin。每次检验用10 ng cDNA和Universal TaqMan master mix 2X在测序点重复三遍，所有信号均可通过ABI PRISMR 7700系统检测。

1.6 伦理声明 本试验的动物及操作符合西安交通大学附属第二医院动物保护和使用委员会要求，并符合全国实验动物标准化技术委员会发布的《动物实验通用要求》。针对实验动物的使用方案和详细的申请表格已获西安交通大学附属第二医院伦理委员会审核通过。

2 结 果

2.1 一般资料 既往文献报道Foxl2-/-小鼠多于出生后不久就死亡[4]，幸存小鼠体型发育相对较小，血浆IGF1水平有所降低。我们的试验扩大了样本量，从而定量分析雌性小鼠生育能力和后代的存活、生长特征。Foxl2+/-雌性小鼠生育能力显著降低，Foxl2-/-小鼠的一胎生仔数仅为野生型小鼠的40%。野生型和Foxl2-/-新生小鼠遵循孟德尔遗传定律(χ2=3.51，185例新生小鼠)，但出生后可出现不明原因的惊厥样发作，死亡率高达82%。为避免雌性小鼠激素水平影响表型造成偏倚，本试验全纳入雄性Foxl2-/-小鼠。

2.2 发育期生长加速迟缓导致Foxl2-/-成年小鼠体格减小 比较Foxl2-/-小鼠生长期间体型，同窝WT和Foxl2-/-小鼠出生时体重和身长相当。出生后100 d(P100)内，WT小鼠生长呈三相曲线(见图1)，新生儿期生长加速，而后生长速率陡降，断奶后又迎来生长突增。不同之处在于，WT小鼠在中间段的生长速率仅单纯下降，Foxl2-/-小鼠此期却出现生长停滞。并且，随后的生长突增，WT小鼠开始于P12，Foxl2-/-小鼠延迟至P20。P20时，WT和Foxl2-/-小鼠的体重、身长已有显著差异(P<0.05)，P100时Foxl2-/-小鼠的体重、身长分别比WT小鼠低29.4%、10.6%。根据连续时间点的小鼠体重绘制特异性生长速率图，可见在P40内，WT小鼠的生长速率都高于Foxl2-/-小鼠，随后变得不相上下，此后趋于稳定。

2.3 Foxl2-/-小鼠生长激素(growth hormone，GH)/IGF1轴受损 Foxl2-/-小鼠的血清IGF1水平较低，本实验又研究了变异小鼠GH/IGF1轴改变与异常生长发育是否存在相关性[4]。经RT-qPCR，P7时即可在WT小鼠的下丘脑、垂体和颅盖骨检测到Foxl2，肝脏中检测不到。若下丘脑的Foxl2表达量定为1，则颅盖骨和垂体的表达量分别是其10、244倍。在Foxl2-/-小鼠的同一组织内，比较下丘脑-垂体-骨轴上的标记物表达量，结果发现Foxl2-/-小鼠的下丘脑生长激素释放激素上调，而垂体Ghrh受体和生长激素下调，而Igf1基因在颅盖骨和肝脏中均可检测到(见图2)。

2.4 Foxl2-/-小鼠骨骼表型特征 新生同窝WT和Foxl2-/-小鼠仅可通过眼睑发育不全加以区别，到2～3周时，Foxl2-/-小鼠开始出现短鼻和牙反合。牙反合随门牙不断增长而越发明显，出生后13～15 d开始每两天对其下门牙做修剪以利生存。

用阿尔新兰/茜素红进行骨架染色，发现Foxl2-/-小鼠骨骼形成异常。4周时，Foxl2-/-小鼠头部明显较短，上颌骨、前颌骨、鼻骨发育不足。因圆拱形的颅盖骨、大小相对正常的下颌骨和其他面部小骨骼共同导致了明显的牙反合(见图3)。4周后，两种小鼠出现体型差异，Foxl2-/-小鼠有明显的脊柱过度前凸和后凸。通过放射显影和茜素红染色对比观察到，Foxl2-/-和WT小鼠的体型和脊柱存在显著差异，成年Foxl2-/-小鼠骨骼染色较WT小鼠颜色更淡，提示骨量减少(见图4)。

2.5 Foxl2-/-小鼠存在骨骼发育迟缓和软骨成熟缺陷 为探明新生和成年小鼠骨骼异常的缘由，我们检测了WT和Foxl2-/-小鼠的胚胎。如图5，交配后12.5 d(12.5 dpc)，经阿尔新兰/核固红和硝酸银染色后发现，Foxl2-/-小鼠椎体致密度受损(vc)，椎间间质中(im)，间充质紊乱(mt、箭头处)、细胞数少，且阿尔新兰染色略显苍白，提示致密软骨形成延迟或减少(见图5)。14.5 dpc和15.5 dpc时，Foxl2-/-小鼠胸椎处(Mk)可见成熟软骨排列紊乱，同时WT小鼠该处着色较深，提示其软骨已开始钙化(见图6)。16.5dpc时Foxl2-/-小鼠椎体仍矿化不足(见图7)。以上结果表明，Foxl2-/-小鼠存在骨骼发育延迟和软骨成熟缺陷。

3 讨 论

3.1 Foxl2通过GH/IGF1轴影响生长发育 GH以旁分泌形式存在于大多数组织中，其调节是机体生长和发育重要的生理过程，通过直接活化特定的GH受体或由肝脏产生IGF1间接应答GH刺激[12-13]。Gh和Igf1缺陷的小鼠模型出现生长缺陷，但除局部长骨矿化缺陷外并没有显著的骨骼异常[14]。

本试验中，Foxl2-/-小鼠GH/IGF1轴活性降低可解释两种小鼠的生长曲线差异。可能的机制为，Gh负反馈调节Ghrh表达，Foxl2-/-小鼠垂体内缺乏Gh，因此下丘脑Ghrh上调，故Gh在Ghrh通路中的负反馈调节作用明显减弱。而垂体中经Foxl2调节的Gh和Ghrh-r水平降低，也能解释肝脏、骨骼、血清中IGF1水平降低。

a WT、Foxl2-/-小鼠出生后21～23 d(虚线所示)体重开始出现显著差异 b WT、Foxl2-/-小鼠出生后10～30 d(虚线所示)生长速率(dW/dt)出现显著差异 c WT、Foxl2-/-小鼠出生后10～30d(虚线所示)比时生长速率[(dW/dt)*(1/W)]有显著差异

图1 WT、Foxl2-/-小鼠出生后体重-生长曲线比较

a 下丘脑Ghrh上调 b 垂体Ghrh-r和Gh下调 c 颅盖骨和肝脏中Igf 1下调

图2 WT和Foxl2-/-小鼠的IGF1/GH轴基因表达比较

a 腹位像 b 侧位放射显象 c 侧位茜素红染色 d 背位示头骨形态差异

注：白线示Foxl2-/-小鼠筛骨(et)缺失；箭头示Foxl2-/-小鼠额骨隆起；i-人字形骨缝；s-矢状缝；c-冠状缝；if-额间缝

图3 WT与Foxl2-/-成年小鼠头盖骨发育缺陷对比(标尺=1 cm)

a 放射显影 b 茜素红染色

图4 WT和Foxl2-/-成年小鼠骨骼对比(标尺=1 cm)

注：vc-椎体致密度；im-椎间间质；mt-间充质

图5 WT和Foxl2-/-小鼠胚胎软骨形成比较(12.5 dpc，阿尔新兰/核固红和硝酸银染色，×20，标尺=50 μm)

a WT小鼠胚胎软骨细胞 b Foxl2-/-小鼠胚胎软骨细胞

图6 WT和Foxl2-/-小鼠胚胎的骨骼矿化分析(15.5 dpc，×200，标尺=5 μm)

a WT小鼠胚胎软骨细胞 b Foxl2-/-小鼠胚胎软骨细胞

图7 注：np-髓核；vb-椎体WT和Foxl2-/-小鼠胚胎的骨骼矿化分析(16.5 dpc，×200，标尺=5 μm)

3.2 Foxl2对颅面部和骨骼发育的影响 颅骨间质分化自头部轴旁中胚层和颅神经嵴两个不同的胚胎来源，Foxl2-/-小鼠颅面部和骨骼异常表型和骨化受损与神经管上皮细胞和头部间质细胞在9.5 dpc时Foxl2表达缺失有关。这些细胞作为多潜能细胞群，可以分化出许多不同的细胞类型，包括面部软骨和骨[15]。神经管上皮细胞和头部间质细胞中有Foxl2表达，提示Foxl2参与上皮到间充质的转变和间充质细胞分化成软骨细胞和成骨细胞的过程。

根据对Foxl2-/-小鼠模型的全面研究，我们发现Foxl2不仅在卵巢和眼睑发育过程中发挥作用，还可通过GH/IGF1轴特异调节小鼠生长发育。尽管配对的WT和Foxl2-/-小鼠均存在由基因差异引起的骨骼表型差异，但Foxl2是直接还是间接地参与这些调节尚不明确。Foxl2在颅面部、骨和软骨的发育过程中复杂的调节机制，有待今后进一步研究。

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Modulations of FOXL2 on Cartilage and Skeletal Development in Mice

Xue Jianli

(The Second Affiliated Hospital of Xi’an Jiaotong University，Xi’an 710004，China)

Objective Haploinsufficiency of the Foxl2 transcription factor in humans causes Blepharophimosis/Ptosis/Epicanthus Inversus syndrome(BPES)，characterized by eyelid anomalies and premature ovarian failure.Mice lacking Foxl2 recapitulate human eyelid/forehead defects and undergo female gonadal dysgenesis.Our experiment aims to explore the influence of lacking Foxl2 in postnatal growth and embryonic bone and cartilage formation in mice.Methods Foxl2-/-male mice at different stages of development have been characterized and compared to wild type.Body length and weight were measured and growth curves were created.Skeletons were stained with alcian blue and/or alizarin red.Bone and cartilage formation was analyzed by Von Kossa staining and immunofluorescence using anti-Foxl2 antibodies followed by confocal microscopy.Analysis of the GH/IGF1 pathway was done evaluating the expression of several hypothalamic-pituitary-bone axis markers by RT-qPCR.Results Compared to wild-type，Foxl2 null mice are smaller and show skeletal abnormalities and defects in cartilage and bone mineralization，with down-regulation of the GH/IGF1 axis.Conclusion Our results support Foxl2 as a master transcription factor in a spectrum of developmental processes，including growth，cartilage and bone formation.

foxl2；bone development；cartilage development；mice

陕西省社会发展科技攻关项目(2016SF-187)

1008-5572(2017)02-0142-05

R322.7+1

A

2016-03-18

薛建利(1981- )，男，主治医师，西安交通大学第二附属医院骨三科，710004。

薛建利.Foxl2基因对小鼠软骨及骨发育的调控研究[J].实用骨科杂志，2017，23(2)：142-146.

实验研究