TTP对小鼠乳腺癌细胞系4T1凋亡的调控

朱光奎，贺文辉，郑 颖，刘家驹，程子利，钱雪松

(1.河北省滦平县医院内科，河北 滦平 068250；2.河北医科大学临床学院实验中心，河北 石家庄 050031；3.河北医科大学基础医学院免疫学教研室，河北 石家庄 050017)

·论 著·

TTP对小鼠乳腺癌细胞系4T1凋亡的调控

朱光奎1，贺文辉1，郑 颖2，刘家驹1，程子利1，钱雪松3*

(1.河北省滦平县医院内科，河北 滦平 068250；2.河北医科大学临床学院实验中心，河北 石家庄 050031；3.河北医科大学基础医学院免疫学教研室，河北 石家庄 050017)

目的观察TTP (trisetetraprolin) 对小鼠乳腺癌细胞系4T1凋亡的影响。方法构建mTTP真核表达质粒PCR3.1/mTTP；脂质体转染小鼠乳腺癌4T1细胞系并筛选稳定转染克隆；用终浓度0.1 μmol的细胞凋亡诱导剂星形孢菌素处理6 h，流式细胞仪检测细胞凋亡。结果经G418筛选，成功得到稳定转染mTTP的细胞株PCR3.1+mTTP和PCR3.1(阴性对照)，实时定量PCR检测mTTP的表达，4T1细胞转染PCR3.1/mTTP之后，mTTP的表达明显增高。流式细胞仪检测发现，4T1、4T1 PCR3.1和4T1 PCR3.1+mTTP 3种细胞的凋亡率差异无统计学意义，细胞凋亡诱导剂作用后PCR3.1+mTTP细胞凋亡率明显增加，凋亡率为29.5%，而4T1、4T1+PCR3.1细胞的凋亡率分别为17.0%和18.0%。结论成功构建了TTP高表达的小鼠乳腺癌细胞系PCR3.1+mTTP，该细胞对凋亡诱导药物星形孢菌素的敏感性增加。

乳腺肿瘤；细胞凋亡；转染

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，每年新增乳腺癌患者人数约占肿瘤患者的23%[1]。外科手术、放疗、化疗、内分泌等治疗是目前乳腺癌治疗的几种常规手段，但是由于乳腺癌的异质性，使得治疗并非对于所有乳腺癌均有效，肿瘤转移、化疗耐药作为目前尚难克服的问题，仍困扰临床。Tristetraprolin (TTP，又被称ZFP36、TIS11、NUP475和G0S24) 是一种表达在很多组织细胞膜上的锌指体蛋白[2]，具有转录因子活性。TTP首先被发现可以与肿瘤坏死因子α的mRNA的AUrich elements(ARE)区相结合从而促进肿瘤坏死因子α的降解。此外，mTTP还可以调控很多其他的目的基因。本研究拟通过在乳腺癌细胞系4T1中过表达TTP，探讨其对该细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠乳腺癌细胞系4T1、真核表达质粒PCR3.1均为河北医科大学免疫教研室保存。星形孢菌素(Staurosporine)购自日本Wako公司；G418为Sigma公司产品Lipofectamine 2000，购自Invitrogen公司；Annexin-V-Biotin凋亡检测试剂盒，美国Biovision公司产品；SYBR-Premix Ex TaqTM、TrizolTM Reagent核酸分离试剂，均为日本Takara公司产品；M-MLV逆转录酶、dNTP及RNA酶抑制剂购自美国Invitrogen公司。引物合成由上海生物技术公司完成。

1.2 4T1细胞的培养 复苏冻存在液氮罐中的细胞，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基将细胞悬起，置于37 ℃、5% CO2孵育箱培养。待细胞铺满培养瓶面积的 85%左右时用于实验。

1.3 细胞转染 将生长状态良好的细胞4T1以密度(0.5～2)×105/孔置于24孔板，500 μL/孔，24 h后进行转染。使用Lipofectamine 2000分别将空白质粒(PCR3.1)或携带mTTP的表达质粒PCR3.1/mTTP分别转染4T1细胞，转染方法参考Invitrogen公司说明书。将转染的细胞在37 ℃、5% CO2培养箱中培养4～6 h后，更换新鲜的含10%胎牛血清RPMI-1640培养基继续培养18～48 h。然后用G418筛选稳定转染克隆。

1.4 稳定转染克隆筛选 在细胞转染48 h后，加入终浓度为500 mg/L 的G418，隔日更换新鲜的含有G418的完全培养基。在倒置显微镜下观察到空白对照组细胞(即未经转染的4T1细胞)全部死亡后，得到稳定转染4T1 PCR3.1或4T1 PCR3.1+mTTP的细胞系。

1.5 实时定量PCR检测mTTP的表达 G418药筛细胞4周后，将4T1、4T1 PCR3.1和4T1 PCR3.1+mTTP细胞分别以1×106/孔的密度铺于6孔板中。培养过夜后弃掉旧培养液，换用新鲜含RPMI-1640完全培养液继续培养24 h。提取细胞总RNA，反转录后，经实时定量PCR检测细胞的mTTP的表达。PCR扩增置于的引物为β-actin Forward Primer:5′-GCTACAGCTTCACCACCA-CAG-3′；β-actin Reverse Primer:5′-GGTCTTTAC-GGATGTCAACGTC-3′；mTTP Forward Primer:5′-AATCCCTCGGAGG-ACTTTGGAACA-3′；mTTP Reverse Primer:5′-AGTTGCAGTAGGCGAAGT-AGGTGA-3′。

1.6 星形孢菌素诱导细胞凋亡 将4T1、4T1 PCR3.1和4T1 PCR3.1+mTTP细胞分别以1×106/孔的密度铺于6孔板中，待细胞贴壁后，分别加入终浓度为(0.1 μmol)的星形孢菌素，继续培养6 h，收集细胞，流式细胞仪测定细胞凋亡。

1.7 流式细胞仪检测细胞的凋亡 取一次性Falcon试管按顺序依次做好标记。分别取培养状态良好的经星形孢菌素处理或未经处理的4T1、4T1 PCR3.1和4T1 PCR3.1+mTTP细胞，加入到做好标记的Falcon管，用1 mL预冷的PBS洗涤2次。 加1×Binding buffer 把细胞调成1×106cell/mL的单个细胞悬液。每管再分别都加入5 μL碘化丙啶和5 μL Ca2+依赖性磷脂结合蛋白轻轻混匀，室温20 ℃，避光放置15 min。将待检样本3个Falcon试管在流式细胞检测仪上检测细胞凋亡的情况，并保留数据图。

1.8 统计学方法 应用SPSS 18.0软件分析数据。计量资料比较分别采用F检验和q检验；计数资料比较采用χ2检验。P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 瞬时转染后的mTTP表达 将构建好的带目的基因的质粒PCR3.1/mTTP，以及作为对照的质粒PCR3.1，用脂质体Lipofectamine 2000分别转染4T1细胞系，培养48 h后收取细胞，提取总RNA，用实时定量PCR检测mTTP的表达情况。结果显示4T1 PCR3.1+mTTP组mTTP的表达明显高于4T1组和4T1 PCR3.1组(P<0.05)。见表1。

2.2 稳定转染后的mTTP表达 选择最适浓度(500 mg/L)的G418来筛选细胞，4周后建立稳定表达mTTP的4T1 PCR3.1+mTTP细胞系和阴性对照4T1 PCR3.1细胞系。首先在倒置显微镜下观察细胞形态：PCR3.1+mTTP和PCR3.1细胞形态与野生型细胞保持一致，生长状态良好(图1)。收集细胞提取总RNA，实时定量PCR结果显示3种细胞mTTP的表达有明显区别，即PCR3.1+mTTP组的mTTR表达量明显高过于其余2个细胞组(P<0.05)。见表1。

表1 瞬时转染和稳定转染后PCR3.1+mTTP细胞中的mTTP表达Table 1 Expression of mTTP in PCR3.1+mTTP cells after stable transfection and stable transfection

*P<0.05与4T1组比较 #P<0.05与4T1 PCR3.1组比较(q检验)

图1 PCR3.1质粒转染不会导致PCR3.1+mTTP细胞形态的改变( ×100)

2.3 细胞的凋亡情况 4T1和4T1 PCR3.1细胞与4T1 PCR3.1+mTTP细胞的双阳百分比数值分别为4.2%、4.7%、4.5%，差异无统计学意义(χ2=2.850，P>0.05)，说明mTTP对PCR3.1+mTTP细胞的凋亡无明显影响。当在3种细胞中都加入促进凋亡的药物星形孢菌素，继续常规培养6 h，再以流式细胞技术测得的3组细胞的双阳值，依次为29.5%、18.0%、17.0%，显然4T1 PCR3.1+mTTP细胞中的目的基因mTTP，提高了4T1 PCR3.1+mTTP细胞对凋亡诱导剂星形孢菌素的敏感性。

3 讨 论

TTP调节mRNA最有力证据是在TTP基因敲除小鼠的动物模型中研究发现的，在这种TTP基因敲除小鼠的巨噬细胞中肿瘤坏死因子α的mRNA表达非常稳定，也就是说一般的细胞因子在产生后都有一定的半衰期，但是TTP的作用可以增加肿瘤坏死因子mRNA的稳定性，降低衰变的程度，使循环中的肿瘤坏死因子α的浓度非常高，导致系统性的炎症综合征。基因敲除小鼠的主要表现为小鼠骨髓、髓外髓系增生和恶病质，侵蚀性关节炎，结膜炎，皮炎，肾小球系膜增厚，高滴度的抗DNA和抗核抗体[3-4]。后来又发现TTP可以调节白细胞介素6、白细胞介素10，白细胞介素23等，这些因子大多与炎症相关联。众所周知，炎症与肿瘤有着千丝万缕的联系，慢性感染和炎症是肿瘤发生的重要诱因，TTP对炎症因子的调节可以直接或间接影响到肿瘤的发生和发展。TTP在一些肿瘤细胞中的表达过低。本研究旨在了解TTP在乳腺癌细胞系4T1中过表达后，对肿瘤细胞凋亡的影响。本研究成功地制备了过表达TTP的乳腺癌细胞系PCR3.1+mTTP，TTP在没有促凋亡因素存在的情况下并不会提高细胞的凋亡率，但是在加入促凋亡药物后可以提高肿瘤细胞的凋亡率，故TTP可以提高癌细胞对凋亡诱导药物的敏感性。

肿瘤细胞通常是通过破坏一个主要的通路完成细胞的非正常生长和恶变的。TTP作为一个潜在的肿瘤抑制因子，可通过与其他分子的ARE区结合参与肿瘤细胞活性的调节，影响肿瘤的发展。有研究者报道，肿瘤细胞中表达TTP可以降低白细胞介素3的水平[5-6]，而白细胞介素3在肿瘤中异常高表达，因为肿瘤细胞的增殖是通过白细胞介素3的自分泌途径实现的，所以通过TTP抑制白细胞介素3的合成就可以减缓肿瘤的生长，并且在肿瘤接种的活体模型中可以显著地减缓肿瘤的形成。因此，TTP被称为肿瘤抑制器[7-8]。有文献报道，乳腺癌TTP的表达和肿瘤的进展呈现负性相关，乳腺癌患者低表达TTP比高表达预后要差；TTP的基因多态性与乳腺癌患者对曲妥单抗的反应性下降有关[9]。

细胞的死亡通常有2种形式：一种是病理性死亡，称为坏死(necrosis)，是由于局部缺血、高热、理化因素及微生物侵袭导致的细胞急速死亡，细胞发生坏死重要的特点是细胞肿胀、溶解，释放出裂解产物，使周围组织发生炎症反应；另外一种是生理性死亡——凋亡，又称程序性死亡。在凋亡发生的早期，细胞核固缩、边缘化，胞浆发生浓缩，凋亡晚期细胞核片段化，被膜包裹、隆起并且产生凋亡小体，最后被巨噬细胞吞噬，在溶酶体内发生降解。与细胞坏死相比，凋亡不造成周围组织的炎症反应。肿瘤的发生不仅与细胞的异常增殖和分化有关，也与细胞凋亡的异常有关。未经治疗的恶性肿瘤有细胞凋亡发生[10]。1972年Kerr等在提出凋亡概念的同时预测：恶性肿瘤中的自发凋亡可能会涉及到导致肿瘤消退的治疗作用。肿瘤自发凋亡的常见原因有以下几个：①缺血、缺氧所激发的凋亡，肿瘤组织内部接近融合灶的部位容易发生供血和供氧的不足；②存在于肿瘤组织内部的巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α，肿瘤坏死因子α结合肿瘤坏死因子受体1激活caspase-3途径引起凋亡；③ 细胞毒性T淋巴细胞攻击载有靶抗原的肿瘤细胞引起凋亡，这种凋亡是经颗粒酶β(granzyme β)激活caspases途径而发生的。肿瘤细胞中的自发凋亡是机体抗肿瘤的一种保护机制，是细胞受损后机体将有害细胞清除的生理途径。本研究发现，TTP在乳腺癌细胞系4T1的高表达虽然不能直接导致肿瘤细胞凋亡的增加，但是在使用促进细胞凋亡的药物后明显提高了肿瘤细胞的凋亡率[11-12]。

综上所述，TTP在乳腺癌细胞系4T1的高表达虽然不能直接导致肿瘤细胞凋亡的增加，但可以增加对细胞凋亡诱导药物的敏感性。

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(本文编辑：刘斯静)

The apoptosis regulation on mice breast cancer cell line 4T1 by TTP

ZHU Guang-kui1, HE Wen-hui1,ZHENG Ying2， LIU Jia-ju1, CHENG Zi-li1, QIAN Xue-song3*

(1.DepartmentofInternalMedicine，theHospitalofLuanpingCounty,HebeiProvince，Luanping068250,China；2.TheExperimentCenter,ClinicalCollegeofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031,China；3.DepartmentofImmunology,theSchoolofBasicMedicalSciences,HebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050017,China)

Objective To establish a mouse breast cancer cell line 4T1 with high TTP (trisetetraprolin) expression and to observe the effect of TTP on breast cancer cell line 4T1 apoptosis. Methods The breast cancer 4T1 cell line was stably transfected with the plasmids of PCR3.1 and PCR3.1/mTTP by Lipofectamine 2000. The cell apoptosis was detected using flow cytometry technology. Results Higher mTTP expression was detected in 4T1 cells that has been transfected with PCR3.1+mTTP plasmid using real time quantitative PCR. The apoptosis rate among 4T1, 4T1 PCR3.1 and 4T1 PCR3.1+mTTP was not significant difference. But after treatment the cells with Staurosporine, a apoptosis promoting medicine, for 6 hours, apoptosis rate of 4T1 PCR3.1+mTTP cell line was increased. The apoptosis rate of 4T1, 4T1 PCR3.1 and 4T1 PCR3.1+mTTP was 17%, 18% and 29.5%, respectively. Conclusion mTTP could not enhance 4T1 cell apoptosis directly, but it could increase the sensitivity of 4T1 to apoptosis inducing medicine.

breast neoplasms； apoptosis； transfection

2016-09-24；

2016-10-30

教育部留学人员科研启动资金；河北省留学人员科技活动资助项目(2014003031)

朱光奎(1977-)，男，河北承德人，河北省滦平县医

院主治医师，医学学士，从事内科疾病诊治研究。

R737.9

A

1007-3205(2017)02-0129-04

10.3969/j.issn.1007-3205.2017.02.002

*通讯作者。 E-mail：13363856305@163.com