低电压脉冲电场对花楸果汁大肠杆菌灭活工艺优化
2017-03-08王艳丽张海平孙爱东
王艳丽,朱 宁,于 宁,张海平,朱 月,孙爱东
(1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系,北京 100083;2.北京林业大学林业食品加工与安全北京市重点实验室,北京 100083)
低电压脉冲电场对花楸果汁大肠杆菌灭活工艺优化
王艳丽,朱 宁,于 宁,张海平,朱 月,孙爱东*
(1.北京林业大学生物科学与技术学院食品科学与工程系,北京 100083;2.北京林业大学林业食品加工与安全北京市重点实验室,北京 100083)
为探寻低电压脉冲电场对花楸果汁中大肠杆菌的灭活效果,实验考察了在指数衰减波的作用下,电压、电容、电阻、介质电导率及处理次数对大肠杆菌致死率的影响。经单因素及正交优化实验得到最佳处理工艺为:电压400 V,电容300 μF,介质电导率0.5 mS/cm,处理次数3次,该条件下大肠杆菌致死率达到2.242。实验结果表明,低电压脉冲电场可以达到有效杀灭果汁中微生物的目的,这为该技术的进一步研究提供了理论基础。
低电压,脉冲电场,花楸,大肠杆菌,致死率
花楸是蔷薇科落叶灌木或小乔木[1],于上世纪九十年代引入我国,主要种植于辽西地区[2-3]。花楸中富含黄酮、花青素、双联苯酚、类山梨酸苷、生氰苷等成分,并具有强抗氧化、抗癌、抗辐射和止咳平喘等药理作用[4-7],具有良好的开发前景,如制成果汁、果酒、果干等。但目前果蔬制品大多采用热杀菌工艺,过程中常伴随着功能性成分的破坏,大大降低了果蔬制品的食用价值。
脉冲电场作为一种安全无污染的非热杀菌方式,能有效减少食品在处理过程中感官品质及物理性质的变化[8],因而在食品领域得到了越来越广泛的研究和应用。目前,脉冲电场已成功应用于牛奶、啤酒、葡萄酒、番茄汁等液体食品[9-10]。然而传统的脉冲电场杀菌设备需要外界提供几千伏至几十千伏的高电压[11]才能达到有效杀灭微生物的目的,对脉冲发生器要求较高,同时对操作人员存在安全隐患,极大地限制了脉冲电场这一非热杀菌方式的工业化应用。因此,如何在低电压范围内有效杀灭微生物成为脉冲电场技术研究的新课题。本文探讨了在低电压范围内(≤400 V),使用指数衰减波作用于花楸果汁中的大肠杆菌时,电压、电容、电阻、介质电导率及处理次数对大肠杆菌致死率的影响,以期为后续研究提供理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
黑果腺肋花楸 吉林省延边市,成熟果实为紫黑色,于-80 ℃冷藏待用;大肠杆菌菌种(Escherichiacoli,CGMCC1.1739) 中国科学院上海生物化学研究所;LB营养琼脂培养基 北京奥博星生物技术有限公司。
THERMO 702型超低温冰箱 美国Thermo Fisher SCIENTIFIC公司;BCD-649WLE型冰箱 青岛海尔股份有限公司;MJ-BL25B3型搅拌机 广东美的生活电器制造有限公司;L3660D型低速离心机 上海知信实验仪器技术有限公司;TS-100B型台式恒温振荡器 上海天呈实验仪器制造有限公司;UV-6100型紫外/可见分光光度计 上海元析仪器有限公司;DK-98-Ⅱ电子调温万用电炉 天津泰斯特仪器有限公司;LDZX-30KBS型立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂;RSPO1-B型数字注射泵(进样系统) 嘉善瑞创电子科技有限公司;ECM-830型细胞电穿孔信号发生器(脉冲发生器) 美国BTX公司;处理室 由北京林业大学功能性食品创新研究室自主研发,处理室使用平行板电极结构,电极间距为100 μm,低电压脉冲电场灭菌装置示意图见图1,电路示意图见图2。
图1 低电压脉冲电场装置示意图Fig.1 Schematic diagram of low-voltagepulsed electric field equipment
图2 低电压脉冲电场电路示意图Fig.2 Circuit diagram of low-voltagepulsed electric field equipment
1.2 实验方法
1.2.1 花楸果汁制备 实验前将花楸从超低温冰箱中取出,先放置于-20 ℃冰箱中冷冻过夜,再经常温解冻,清洗后榨汁,4000 r/min离心20 min,离心所得上清液通过8层纱布过滤后经高压蒸汽灭菌(121 ℃,20 min),冷却至室温后按1%接种量接种大肠杆菌菌悬液,菌体浓度达到106～108cfu/mL,备用,果汁电导率约为1.0 mS/cm。
1.2.2 微生物数量测定 微生物数量测定按照GB/T 4789.2-2010[12]中方法进行。
1.2.3 大肠杆菌生长曲线测定 吸取大肠杆菌培养液,按1%接种量接种于含LB液体培养基的试管中,于恒温振荡器中振荡培养(150 r/min,37 ℃)。当培养时间为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18 h 时各取出一支试管,以未接种的培养基作为空白对照,测定各试管中菌悬液在600 nm处的吸光值,平行测定3次。
1.2.4 低电压脉冲电场杀菌 低电压脉冲电场杀菌设备放置于超净工作台内,使用前打开紫外灯杀菌30 min,除人员操作时间外保持紫外灯处于打开状态,以防止微生物污染。进样管路及样品收集管路均可拆卸,使用前经高压蒸汽灭菌,使用时使用无菌水冲洗5 min,以最大程度保证管路的无菌状态。各实验均重复操作3次。
1.2.4.1 电压对杀菌效果的影响 设定电容为400 μF,电阻100 Ω,果汁电导率为1.0 mS/cm,设置电压分别为200、250、300、350、400 V,处理次数为1次,考察不同电压对大肠杆菌灭活效果的影响。
1.2.4.2 电容对杀菌效果的影响 设定电压为400 V,电阻100 Ω,果汁电导率为1.0 mS/cm,设置电容分别为100、200、300、400、500、600 μF,处理次数为1次,考察不同电容对大肠杆菌灭活效果的影响。
1.2.4.3 电阻对杀菌效果的影响 设定电压为400 V,电容400 μF,果汁电导率为1.0 mS/cm,设置电阻分别为100、200、300、400、500 Ω,处理次数为1次,考察不同电阻对大肠杆菌灭活效果的影响。
1.2.4.4 果汁电导率对杀菌效果的影响 设定电压为400 V,电阻100 Ω,电容400 μF,调节NaCl含量使果汁电导率分别为0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mS/cm,处理次数为1次,考察不同电导率对大肠杆菌灭活效果的影响。
1.2.4.5 处理次数对杀菌效果的影响 设定电阻为100 Ω,电容400 μF,调节果汁电导率为0.5 mS/cm,在不同电压(200、250、300、350、400 V)下分别处理1、2、3次,考察不同处理次数对大肠杆菌灭活效果的影响。
1.2.4.6 正交优化实验 根据单因素实验结果,选取电压、电容、电导率和处理次数4个因素进行正交优化实验,以期得到最优杀菌工艺,正交实验因素水平见表1。
表1 正交实验因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
1.2.5 计数方式 杀菌效果用致死率对数值lg S表示:
lg S=lg(N0/N)
式中:N0为处理前微生物数,cfu/mL;N为处理后微生物数,cfu/mL。
1.3 数据处理
采用Microsoft Excel 2003软件进行数据处理,结果以平均值±标准差表示。
2 结果与讨论
2.1 大肠杆菌生长曲线测定结果
大肠杆菌生长曲线测定结果见图3。由图3可知大肠杆菌延迟生长期处于0～2 h之间,对数生长期为2～10 h之间,其中对数初期、中期、末期分别出现在培养2、6、10 h,稳定初期为培养10 h。由于处于对数期的细胞群体在细胞的化学组成、代谢活性和其他一些特性方面均最为接近一致[13],且对脉冲电场最为敏感[14],能最大程度反映出脉冲电场的致死作用,因此后续实验中选择培养时间为6.5 h的大肠杆菌作为处理对象。
图3 大肠杆菌生长曲线Fig.3 Growth curve of E. coli
2.2 单因素实验
2.2.1 电压对花楸果汁中大肠杆菌灭活效果的影响 电压对花楸果汁中大肠杆菌灭活效果的影响见图4。可知,随着电压的升高,大肠杆菌致死率明显增大。当电压升至350 V后,致死率呈缓慢上升趋势。分析可知,平行板电极电场强度随着电压增大而增大,场强的增加会明显促进微生物的死亡[14]。综合考虑灭活效果及低电压范围(≤400 V),正交实验中选取300、350、400 V三个水平。
图4 电压对大肠杆菌灭活效果的影响Fig.4 Effect of voltage on inactivation of E. coli
图5 电容对大肠杆菌灭活效果的影响Fig.5 Effect of capacitance on inactivation of E. coli
2.2.3 电阻对花楸果汁中大肠杆菌灭活效果的影响 电阻对花楸果汁中大肠杆菌的灭活效果见图6。由图6可知,电阻的变化对大肠杆菌的致死率无显著影响(p=0.066>0.05)。电阻的大小主要改变电路中电流的大小,而对果汁中微生物跨膜电压的形成并无显著影响。由于在脉冲电场作用下,微生物的死亡主要与其跨膜电压的形成有关[15-17],因此,电阻这一参数的改变对杀菌效果无显著影响。
图6 电阻对大肠杆菌灭活效果的影响Fig.6 Effect of resistance on inactivation of E. coli
2.2.4 果汁电导率对花楸果汁中大肠杆菌灭活效果的影响 果汁电导率对花楸果汁中大肠杆菌灭活效果的影响见图7。由图7可知,随着电导率的增加,大肠杆菌致死率逐渐减小。当电导率为0.5 mS/cm时,大肠杆菌致死率最大,为1.710;当果汁电导率增加至2.0 mS/cm后,大肠杆菌致死率降低至0.13。分析可知,介质电导率对大肠杆菌的灭活效果存在显著影响(p<0.01),当介质电导率超过一定范围后,低电压脉冲电场无法有效杀灭大肠杆菌。这是由于电导率大的食品会在处理室中产生很小的峰值电场,使处理室两端的电压难以升高,不利于脉冲电场杀菌[18]。由于继续减小果汁电导率,会导致果汁颜色发生明显改变,严重影响其感官品质,因此正交实验中选择0.5、1.0、1.5 mS/cm三个水平。
图7 电导率对大肠杆菌灭活效果的影响Fig.7 Effect of conductivity on inactivation of E. coli
表3 低电压脉冲电场灭活大肠杆菌正交实验方差分析表Table 3 Analysis of variance for the orthogonal array design for optimizationof inactivation of E. coli by low-voltage pulsed electric field
注:“***”表示F
图8 不同电压下处理次数对大肠杆菌灭活效果的影响Fig.8 Effect of treatment times on inactivation of E. coli under different voltages
2.3 正交优化实验
根据单因素实验结果,设计正交优化实验,正交实验结果见表2。
表2 低电压脉冲电场灭活大肠杆菌正交实验设计及结果Table 2 Orthogonal array design and results for optimizationofinactivation of E. coli by low-voltage pulsed electric field
由表3中极差分析结果可知,各因素对大肠杆菌灭活效果的影响大小依次为D>A>B>C,即处理次数>介质电导率>电压>电容,最佳工艺组合为A1B3C3D3,在此条件下大肠杆菌致死率为2.388±0.044;由方差分析结果可知,A、B、D因素对结果影响高度显著,C因素对结果影响不显著,故为降低能量消耗,最佳工艺组合确定为A1B3C1D3,即果汁电导率为0.5 mS/cm,处理电压为400 V,电容300 μF,处理次数为3次。在此条件下进行验证实验,得到大肠杆菌平均致死率为2.242,与正交实验得出的最佳工艺相比,致死率无明显降低。
3 结论
[1]金伟,平雪良,吉祥,等. 高压脉冲电场杀菌系统的研究进展[J]. 食品与机械,2012,28(1):247-249,258.
[2]马兴华. 优良的经济树种——黑果腺肋花楸[J]. 林业科技通讯,1992(11):31-33.
[3]王鹏. 欧美国家黑果腺肋花楸栽培技术研究现状[J]. 中南林业调查规划,2014(1):54-57.
[4]于明,李铣. 花楸属植物化学成分药理作用及其研究进展[J]. 辽宁中医学院学报,2004,6(5):364-366.
[5]程伟,提古丽·马合木提. 天山花楸不同部位萜类化合物提取工艺研究[J]. 食品科学,2011(6):29-31.
[6]白洁,王艳梅,提古丽·马合木提. 天山花楸全株化学成分定性研究[J]. 食品科学,2009(3):71-73.
[7]杨华,任悦,庞惟俏,等. 5种常见野生浆果的抗紫外线和抗微波辐射性能[J]. 食品科学,2016(3):60-65.
[8]张若兵,陈杰,肖健夫,等. 高压脉冲电场设备及其在食品非热处理中的应用[J]. 高电压技术,2011,37(3):777-786.
[9]Evrendilek G A,Yeom H W,Jin Z T,et al. Safety and quality evaluation of yogurt-based drink processed by pilot plant PEF system[J]. Journal of Food Process Engineering,2004(27):197-212.
[10]Min S,Jin Z T,Zhang Q H. Commercial Scale Pulsed Electric Field Processing of Tomato Juice[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2003,51(11):3338-3344.
[11]严志明.高压脉冲电场对微生物的致死动力学研究以及在橙汁中的应用[D]. 福州:福建农林大学,2007.
[12]GB 47892-2010 食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定[S].
[13]M J小佩尔扎,R D里德,E C S詹. 微生物学[M].北京:科学出版社,1987:116.
[14]陶晓赟.高压脉冲电场(PEF)对蓝莓汁品质及杀菌机理探究[D]. 北京;北京林业大学,2015.
[15]但果,陈思平,汪天富,等. 脉冲电场对微生物细胞作用机理的研究[J]. 深圳大学学报：理工版,2008,25(1):65-70.
[16]熊兰,石岭岭,郑家波,等. 实际指数脉冲电场对细胞跨膜电位的影响[J]. 高电压技术,2013(1):122-128.
[17]魏新劳,李家辉,延二宝. 脉冲电场作用下细菌细胞膜跨膜电压分析[J]. 电机与控制学报,2010(5):84-90.
[18]延二宝.高压脉冲电场灭菌技术的研究[D].哈尔滨:哈尔滨理工大学,2010.
[19]Zhao W,Yang R,Shen X,et al. Lethal and sublethal injury and kinetics of Escherichia coli,Listeria monocytogenes and Staphylococcus aureus in milk by pulsed electric fields[J]. Food Control,2013,32(1):6-12.
[20]Zhao W,Yang R,Zhang H Q,et al. Quantitative and real time detection of pulsed electric field induced damage on Escherichia coli cells and sublethally injured microbial cells using flow cytometry in combination with fluorescent techniques[J]. Food Control,2011,22(3-4):566-573.
[21]García D,Gómez N,Maas P,et al. Occurrence of sublethal injury after pulsed electric fields depending on the micro-organism,the treatment medium ph and the intensity of the treatment investigated[J]. Journal of Applied Microbiology,2005,99(1):94-104.
[22]方婷.高压脉冲电场杀菌动力学及处理室改进研究[D]. 福州:福建农林大学,2008.
Optimization of low-voltage pulsed electric field for inactivation ofEscherichiaColiin rowan juice
WANG Yan-li,ZHU Ning,YU Ning,ZHANG Hai-ping,ZHU Yue,SUN Ai-dong*
(1.Department of Food Science,College of Biological Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China;2.Beijing Foresty University,Key Laboratory of Forestry Food Processing and Security,Beijing 100083,China)
In order to explore the effect of low-voltage electric field on the inactivation ofE.coliin rowan juice,different levels of voltage,capacitance,resistance,medium conductivity and treatment times were tested under the action of exponential decay wave. The results showed that the optimal conditions were obtained as follows:the voltage was 400 V,capacitance was 300 μF,medium conductivity was 0.5 mS/cm,treatment times was 3,and the lethality was 2.242. The low-voltage pulsed electric field could inactivate microbes in juice effectively. This result provided theoretical basis for further research.
low-voltage;pulsed electric field;rowan;E.coli;lethality
2016-08-16
王艳丽(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：天然产物与功能性食品，E-mail:wangyanli03@qq.com。
*通讯作者:孙爱东(1968-)，女，博士，教授，研究方向：天然产物与功能性食品，E-mail：adsun@bjfu.edu.cn。
国家自然科学基金项目 (31471593)；“十三五”国家科技支撑计划项目(2016YFD0400302)。
TS201.3
B
1002-0306(2017)02-0246-05
10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.039
