磁性载药微球联合反义寡核苷酸对人胰腺癌裸鼠模型的疗效观察

赵会庚 权广前 潘耀振 尹家俊

磁性载药微球联合反义寡核苷酸对人胰腺癌裸鼠模型的疗效观察

赵会庚 权广前 潘耀振 尹家俊

目的 探讨辐射促细胞转染的多药耐药(multidrug resistance,MDR)基因mdr1反义寡核苷酸(ASON)联合5-氟尿嘧啶磁性载药微球(PEG-5-FU-MAMS)治疗裸鼠人胰腺癌的效果。方法 通过构建裸鼠人胰腺癌耐药肿瘤模型基础上，肿瘤局部以2 Gy60Coγ辐射，瘤内注射阳性脂质体介导的mdr1反义寡核苷酸(ASON)，经磁导下利用磁性载药微球(PEG-5-MAMS)联合化疗。结果 联合辐射组与未联合辐射组及对照组肿瘤生长曲线肿瘤生长曲线差异有显著性(P<0.01)。联合组能显著抑制肿瘤的生长，联合组肿瘤重量抑制率为85.00%,肿瘤体积抑制率为87.74%。结论 辐射促转染的mdr1ASON联合磁性载药微球对肿瘤细胞具有较好的耐药逆转作用。

电离辐射；反义寡核苷酸；转染；多药耐药；PEG-5-FU-MAMS

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:181～184)

胰腺癌是临床上常见的消化系统恶性肿瘤之一，其发病隐匿，病情进展较快，病死率较高，西方国家的发病率为12.5/10万，患者病死率超过97%[1]。肿瘤细胞的多药耐药是导致肿瘤化疗失败的主要原因。2015年3～11月，我们在建立裸鼠肿瘤耐药模型后，采用辐射促转染的方法，将多药耐药(mdr1)基因逆转剂反义寡核苷酸(ASON)片段导入肿瘤细胞，在磁性载药微球的作用下，探讨体内对肿瘤耐药的逆转作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞系 人胰腺癌细胞系sw1990/Fu(自制)。

1.1.2 主要试剂 5-Fu(Acros,Belgium)；磁性载药微球(天津倍思乐有限公司)；mdr1反义寡核苷酸(ASON)(上海生工生物有限公司)；弧形磁铁(磁感强度3000GS)(北京海空科技开发中心)BALB/c；裸鼠4～6周龄裸鼠20只，体重20～23 g/只，均为雌性，在标准合格的动物实验室饲养。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及裸鼠皮下胰腺癌模型的建立 构建胰腺癌细胞株SW1990用DMEM培养基(含10%胎牛血清)，待细胞至生长对数期，细胞消化，传代。连续传代3次后，当细胞生长至瓶壁约80%面积时，改用含5-Fu的培养基培养，起始浓度为30 mmom/L,24 h后更换无药物的细胞培养液，去除死亡的大部分细胞，以后每2天更换细胞培养基，待细胞与含药物的培养基中稳定的生长并铺满整个培养瓶，以0.25%胰蛋白酶消化传代，一瓶在含原浓度的5-Fu培养基继续传代培养，另一瓶逐渐增加5-Fu浓度至60 mmom/L。继续如上培养，并不断增加药物浓度(一般2周左右增加药物浓度),连续6个月左右，最后建立耐200 mmom/L的5-Fu的胰腺癌细胞株模型表示为SW1990/Fu。

1.2.2 肿瘤的接种 取制备好的人胰腺癌细胞SW1990/Fu悬液0.2 ml,混合0.2 mlPBS分别接种于20只裸鼠的右后腿背侧.观察有无肿瘤形成及注射点有无破溃红肿，按规定测量肿瘤体积，经过3～5天潜伏期，接种部分出现灰白色结节，逐渐肿大，形成圆形或椭圆形，突出体表，待肿瘤长到4～5 mm时，将20只裸鼠随机分4组，每组5只。A组：空白对照组，肿瘤注射磁性载药微球混合悬液。B组：辐射组(2 Gy60Coγ辐射)同时在肿瘤基底部注射磁性载药微球混合悬液。C组：lipo-ASON转染组，肿瘤内注射100 μl的lipo-ASON，同时在肿瘤基底部注射磁性载药微球混合悬液。D组：联合组(辐射+lipo-ASON) 2 Gy60Coγ辐射1 h后，向肿瘤内注射100 μl的lipo-ASON，同时在肿瘤基底部注射磁性载药微球混合悬液(lipo-ASON的浓度是100 mg/L)。

各组注射药后用施加与肿瘤外形相符的弧形磁场，磁场强度3 000 GS，持续时间2 h，以上治疗与药物及辐射同时进行，间隔5天做1次治疗，连续观察20天，记录肿瘤的大小和宿主变化情况，于治疗后30天颈椎脱臼法处死裸鼠，剥离肿瘤，测量肿瘤的长、短径，在电子天平上称质量m,计算各组肿瘤体积V、质量和抑制率。

肿瘤体积=3.14/6a2b。

肿瘤体积抑制率(%)=(对照组肿瘤体积-实验组肿瘤体积)/对照组肿瘤体积×100%体重减轻率(%)=(对照组肿瘤重量-实验组肿瘤重量/对照组肿瘤重量)×100%向细胞培养瓶中加1 ml的Trizol后，室温放置5 min,使其充分裂。转入1.5 ml Eppedndorf管中(RNase-free)12 000 rpm 离心5 min,弃沉淀。向Eppedndorf管中加入200 μl氯仿，震荡均匀后室温放置15 min。(禁用漩涡振荡器，避免基因断裂)；加入1 ml的75%乙醇(高压的DEPC水配制)，温和震荡离心管悬浮沉淀。4 ℃，5 000 rmp离心5 min，弃上清。室温晾干。溶于20 μlDEPC水中测OD值定量RNA的浓度。

1.3 RT-PCR

在冰浴的无RNase得离心管加入以下成分：Total RNA 1ugOligo(dT)18，2 μl离心后向离心管中加入下列各组成分：5×M-MLV Buffer 4 μl，dNTPs 1 μl，Rnasin 0.5 μl，M-MLV1 μl，42 ℃温浴60 min，95 ℃加热5 min 终止反应；-20 ℃保存(或直接PCR)。mdr1基因引物(扩增片段 bp310)：上游引物序列 5-ˊCCC ATC ATT GCA ATA GCA GG-3ˊ；下游引物序列，5-ˊGTT CAA ACT TCT GCT CCT GA-3ˊ；内参β2MG基因引物 (扩增片段bp120)上游引物序列 5-ˊCCA CTG AAA AAG ATG AGT AT-3ˊ下游引物序列 5-ˊCTT CAA CCT CCA TGA TGC TG-3ˊ反义体系：10×PCR Buffer10 μl；上游引物1 μl；下游引物1 μl；内参上游引物1 μl，内参下游引物1 μl；RT反应产物 2 μl；Taq Polymerase1 μl；ddH2O 3 μl；Total Volume 20 μl。PCR的反应条件：95 ℃5 min，50 ℃30 S,72 ℃ 1 min,进行30个循环，然后72 ℃ 10 min后4 ℃保温。

1.4 电泳鉴定

加样：① PCR Marker II 5 μl 加入孔中;② PCR样品:1 μl样品DNA:4 μl 10 x Loading Buffer 混合均匀后依次加入相应的孔中,接通电源，电压110 V 20 min进行电泳;凝胶成像仪成像检测、拍照、定量。

1.5 统计学分析

2 结果

2.1 裸鼠胰腺癌模型的成功建立

肿瘤细胞皮下注射后7～10天肿瘤直径达4～5 mm,成瘤率80%。

2.2 肿瘤体积及肿瘤重量变化(表1)

经PEG-5-FU-MAMS及辐射+lipo-ASON联合治疗后，肿瘤体积明显小于lipo-ASON组(P<0.05)和辐射组(P<0.01)及NS对照组(P<0.01)。磁性载药微球及辐射+ lipo-ASON联合组在外磁场诱导固定下对肿瘤生长有明显的抑制作用，肿瘤没有呈现快速的增长期，到治疗结束时，PEG-5-FU-MAMS及辐射+ lipo-ASON联合组肿瘤的体积抑制率达到85%,肿瘤重量的抑制率达到87.74%，磁性载药微球及辐射+lipo-ASON组联合组肿瘤的体积小于辐射组及lipo-ASON和对照组(P<0.05)，差异有统计学意义(图1)。

图1 各组肿瘤生长曲线

2.3 凝胶成像系统分析结果

经凝胶成像系统对各实验组中的mdr1的mRNA RT-PCR 结果进行分析显示：①A组中mdr1mRNA 的相对表达量为1.94±0.04；②组中mdr1mRNA的相对表达量为1.83±0.07；③C组中mdr1mRNA 的相对表达量为1.22±0.11。D组mdr1mRNA 的相对表达量为0.68±0.10；④D组与A组相比，mdr1mRNA的相对表达量降低了64.94%；C组与A组相比，mdr1mRNA的相对表达量降低了37.11%。A组与C组、D组间差异非常显著，具有统计学意义(t=20.49，P<0.01；t=13.4,P<0.01)；而C组与D组之间，差异也有显著性(t=15.15，P<0.05)。

3 讨论

胰腺癌是1种恶性程度高，进程快的恶性肿瘤，具有发现完、病程短、转移较早、预后差等特点，其发病率在世界范围内呈上升的趋势，已经成为肿瘤患者的主要死亡原因之一。由于胰腺本身的结剖学特点及生物学特性，导致胰腺癌早期诊断困难，易于侵犯周围的大血管和神经，肿瘤很早时就发生远处转移，同时临床上常规化疗、放疗和免疫学治疗均不敏感，因此在肿瘤的治疗过程中，胰腺癌是腹部肿瘤中预后最差的恶性肿瘤。在过去的20年中，虽然影像学诊断、手术技术、围手术期处理及综合治疗等方面均有一定的进展，但胰腺癌5年总的生存率并未提高，仍在的5%以下[2]。临床上化疗作为治疗胰腺癌的重要手段之一，但化疗过程中逐渐产生不敏感、耐药。肿瘤多药耐药的产生严重阻碍了化疗药物在胰腺癌治疗中的应用，肿瘤的多药耐药是指肿瘤细胞接触某一种抗癌药物产生耐药的同时也对其它结构和功能不同的药物产生交叉耐药，从而导致化疗的失败。其中主要是多药耐药基因(MDR1)及其表达产物糖蛋白(P-gp)介导了肿瘤细胞的多药耐药，从而导致化疗的失败，mdrl基因定位于第7号染色体的q21.1，其编码的膜糖蛋白(P-gp)是相对分子质量为170 kD的跨膜磷脂糖蛋白，具有能量依赖的跨膜药物外输泵功能，可将细胞内的药物泵出胞外，使胞内药物浓度降低，产生耐药。反义寡核苷酸(ASON)作为一种治疗肿瘤的基因逆转药物，主要是通过碱基配对原则与靶基因结合，特异性与靶基因mRNA结合，阻断其mRNA的翻译，使该蛋白表达受阻。由于经硫代修饰的反义寡核苷酸(ASON)在体内有稳定而较长的半衰期，能主动代谢，保持与MDR1竞争结合，能提高化疗的疗效，从而达到治疗肿瘤的目的[3]。Nicolas Skrypek等[4]应用针对mdr1起始密码AUG的反义聚硫代磷寡核苷酸，以阳性脂质体为载体作用肝癌耐药细胞，发现经过反义硫代寡核苷酸可增加耐药细胞对化疗细胞的敏感性部分逆转耐药细胞的耐药性，但同时也要找到1种高效的转染方法，把反义硫代寡核苷酸转入肿瘤细胞内。同样随着新型化疗药物磁性载药微球的研制成功,也为实现肿瘤靶向治疗带来新的希望。磁导向下载药微球靶向治疗肿瘤的作用机理是将微球注入瘤体或血管内同时在肿瘤外部施加有效强度和梯度的外磁场，使磁性载药微球相对集中聚集于肿瘤组织内，并停留较长的时间，缓慢释放药物，达到靶向肿瘤治疗目的。由于磁场对细胞有穿透作用，肿瘤细胞在磁场的作用下，膜表面的带电粒子由于受到洛仑磁力的影响，导致了肿瘤细胞膜上的电子和离子不能正常的运动和传递，引起了肿瘤细胞膜微观结构的变化，从而影响了细胞膜的通透性和有序性[5]，影响细胞的生长。也有人认为，磁场作为1种物理场，对肿瘤细胞的DNA会产生一定程度的损伤和抑制，此外癌细胞与正常的区别在于不进入细胞的的正常的凋亡程序而出现恶性增值，磁场作用于癌细胞后，它产生的感性电流会先作用与细胞膜，影响其跨膜电位，导致钙浓度升高，从而激活DNA内切酶,使逃离细胞凋亡程序的癌细胞凋亡。这使逆转试剂(反义的寡核苷酸)及新型化疗药物(磁性载药微球)在磁导下分子更快、更多穿透细胞膜提供了条件，这可能是磁场与化疗药物协同作用抑制其多药耐药基因的表达原因之一[6]。鉴于胰腺癌临床常用的化疗药物是5-FU和盐酸吉西他滨等，而研究最多是5-FU 该药主要作用细胞周期S期，抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶，对细胞增殖期肿瘤有明显的抑制作用，由此我们制备了5-FU磁性载药微球作为化疗药物与辐射逆转剂联合治疗胰腺癌。

表1 四组裸鼠治疗后肿瘤体积及重量抑制情况

在肿瘤动物模型复制方面，我们采取先种后处理的方式。大量研究表明，人体肿瘤/裸鼠系统是研究人体肿瘤的一种较为理想的模型系统，因异体移植后的人体肿瘤在裸鼠体内人保持原有的组织形态、免疫学特点及特有的染色体组型以及对抗癌药盒电离辐射原有的特征[7]。

可见磁性载药微球(PEG-5-FU-MAMS)联合辐射反义寡核苷酸(ASON)基因逆转染剂(lipo-ASON)不仅在耐药肿瘤的治疗方面要显著优于单一的辐射及反义寡核苷酸(ASON)基因逆转剂(lipo-ASON)，而且对实验动物的生存质量的影响也明显低于单一辐射及逆转剂(lipo-ASON)组。

同时在肿瘤的治疗效果上，也存在一些缺陷和不足，合成的反义寡核苷酸(ASON)基因逆转染剂(lipo-ASON)转入肿瘤细胞的量对肿瘤的抑制存在一定的影响[8]，我们仅是参考说明书配置反义寡核苷酸(ASON)与转染剂阳性脂质体的比例，这在不同细胞之间会造成一定差异，从而影响疗效，此外合成的磁性载药微球(PEG-5-FU-MAMS)中5-FU的载药量对肿瘤的治疗也存在一定的影响，本实验磁性载药微球的合成是通过天津倍思乐色谱技术中心制备，5-FU在载药量仅有3.2%，与相关文献报道的5-FU的载药量为5.37%有一定的差异，这也是影响肿瘤治疗效果的原因之一[9]。

实验研究表明，作为新型抗癌磁性药物磁性载药微球联合辐射及联合反义寡核苷酸(ASON)基因逆转剂对人胰腺癌耐药的治疗有很好的研究和临床应用前景,为临床治疗胰腺癌提供新的治疗思路。

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(编辑：吴小红)

Reversal of Multidrug Resistance Antisense Oligodeoxynucletedes and PEG-5-FU-MAMS for Human Pancreatic Carcinoma Model in Nude Mice

ZHAOHuigeng,QUANGuangqian,PANYaozhen,etal.

AffiliatedZhongshanHospitalofDalianUniversity,Dalian,116001

Objective To investigate the efficacy of reversal of multidrug resisitance(MDR) by MDR gene mdrl antisense oligodeoxynucletdes(ASON) and Polyethylene Glycol modified 5-Fluorouracil magnetic albumin miscrospheres(PEG-5-FU-MAMS) for the human pancreatic cancer cell line in SW1990/Fu,and realize magnetic targeted therapy the human pancreatic cancer in nude mouse model.Methods dr1 ASON was injected into the tumor 1 hour after local 2 Gy60 Coγirradition.The tumor-suppressing rate and tumor-suppressing curve were observed in the 2 groups of cells after treatment with Polyethylene Glycol modified 5-Fluorouracil magnetic albumin miscrospheres(PEG-5-FU-MAMS).Results Significant differences in tumor weight and tumor volume were also observed between the 2 different treat group(P<0.01).The suppressing rates of tumor volume and weight were 87.74%and 85.00% respectively in grouop accepted combined radiation.Conclusion The reversal effect of mdr1 ASON and ionizing radiation plus Polyethy-lene Glycol modified 5-Fluorouracil magnetic albumin miscrospheres(PEG-5-FU-MAMS) is stronger on resistant cell than that of mdr1 ASON and Polyethylene Glycol modified 5-Fluorouracil magnetic albumin miscrospheres(PEG-5-FU-MAMS) alone.

Ionizing radition;Antisense Oligodeoxynuce-letides;Gene transfection;Multidrug resistance;PEG-5-FU-MAMS

辽宁省自然科学基金(编号：201102006)

116001 大连大学附属中山医院

尹家俊

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.02.003

R735.9

A

1001-5930(2017)02-0181-04

2016-03-20

2016-11-15)