Wnt信号通路在姜黄素诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡中作用机制

赵轶峰 杨永江 王晓元 梁晚平 李秀娟 黄 迪 高晓斌 魏玉磊

Wnt信号通路在姜黄素诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡中作用机制

赵轶峰 杨永江 王晓元 梁晚平 李秀娟 黄 迪 高晓斌 魏玉磊

目的 探讨Wnt通路在姜黄素诱导人乳腺癌 MCF-7细胞凋亡中的作用机制。方法 将MCF-7细胞培养液随机分为5组，分别加入15、30、60、120 μmol/L的姜黄素，对照组不加，培养 12，24，48 h 后采用CCK-8法检测细胞增殖能力。分A、B两组(剂量组、时间组) 采用Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术(FCM)观测细胞凋亡及细胞周期分布；Western Blotting法检测A、B两组的Wnt通路相关蛋白，并进行相应的相关性分析探讨Wnt通路与乳腺癌MCF-7细胞凋亡的关系。结果 CCK-8结果显示，随培养时间延长，姜黄素各浓度组MCF-7细胞增殖抑制率逐渐增高(均P<0.05)；在同一时间点，随着姜黄素浓度升高，细胞增殖抑制率逐渐增高(均P<0.05) 。FCM染色结果显示，随着姜黄素浓度增加、作用时间延长MCF-7细胞凋亡指数逐渐上升(均P<0.05)，且G1/S期细胞增加越多(P<0.05)。Western Blotting实验结果显示MCF-7细胞中Wnt1、β-catenin的表达下调程度呈现剂量时间依赖性 (P<0.05)。相关性分析显示细胞抑制率、G0/G1期细胞百分比、细胞凋亡率均与Wnt 通路相关蛋白Wnt1、β-catenin的表达呈现较明显的相关性(P<0.05)。结论 姜黄素的抗癌活性与抗增殖能力具有明显的剂量时间依赖性，且Wnt通路在姜黄素诱导乳腺癌MCF-7细胞抑制、凋亡过程中发挥了重要作用。

Wnt信号通路;姜黄素;MCF-7细胞;细胞凋亡

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:188～191)

姜黄素是提取于天然中草药中的1种植物多酚，毒性低下，具有广泛的抗炎、抗氧化、降血脂、抗突变、抗肿瘤的药理作用。有研究指出姜黄素对多种肿瘤有明显的抑制或杀伤作用，且参与人体多条信号通路的调控，Wnt 信号便是重要的一条[1]。经典Wnt 信号通路(Wnt/β-catenin 通路)由细胞外的配体(Wnt 家族分子)、细胞膜的受体(Frizzled家族分子和 LRP-5/6)、胞浆内的信号传导蛋白(Dsh、APCAxin、GSK-3β、CK-1、β-catenin 等)及核内转录调控部分(TCF/LEF1 家族)组成[2]，参与了多项生物学功能的调控，主要是通过调节胞质β-catenin的磷酸化与降解进行的。正常情况下，大部分β-catenin与 E 钙黏附蛋白(E-cadherin) 和细胞骨架蛋白(Actin)结合，以稳定形式存在；只有少部分与细胞质中的APC)、GSK3β 及Axin 结合形成“降解复合物”，随后进行降解使胞质内游离的 β-catenin 维持在低水平，难以进入细胞核。一旦有了Wnt 信号，可以与跨膜受体 Frizzled 家族分子和 LRP-5/6 结合，并作用于胞质内的 Dvl，破坏降解 β-catenin 的多蛋白复合物，使得非磷酸化 β-cateninβ-catenin 在细胞质的水平得到累积，转位进入细胞核，激Wnt 相关靶基因(C-myc、Cyclin D1等)[3-4]。Wnt 通路的关键是胞浆中是否存在结构稳定的、可溶性的β-catenin[5]。Wnt通路的失调及过度激活与多种癌症(结肠癌、胃癌、乳腺癌等)的发生发展相关。然而目前对姜黄素在肿瘤细胞中发挥生物学作用的精确靶点还不十分清楚。本研究本研究将姜黄素作用于乳腺癌 MCF-7 细胞，观察姜黄素对乳腺癌 MCF-7 细胞的生长及 Wnt 信号通路的影响，并探讨Wnt通路在姜黄素诱导乳腺癌MCF-7细胞凋亡中机制。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人乳腺癌 MCF-7，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库。将细胞单层接种在DMEM 培养液(购自美国GIBCO公司，含 10%FBS 、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素，无菌过滤)中,在37 ℃、5%二氧化碳培养箱中培养，待细胞密度长至80%时对其用0.25%胰酶及0.02% EDTA将贴壁生长的细胞用直接吹打法传代。过夜待其贴壁后,取对数生长期细胞进行实验。

1.2 姜黄素配制

姜黄素(试剂纯度>95%)，由河北北方学院生命科学研究中心提供。采用二甲基亚砜(DMSO)进行溶解,配制成 1 mmol/L 待用，储存于-20 ℃冰箱进行冷冻保存。试验时根据所需的浓度(0、15、30、60、120 μmol/L)将储存的姜黄素进行稀释，其中不含药的细胞培养液组作为空白对照组。并按所需浓度向人乳腺癌 MCF-7细胞中加入姜黄素溶液，细胞处理 12 h、24 h、48 h后进行相关实验。

分为A、B两组进行FCM及Western blot实验。A组为剂量组,即0、15、30、60、120 μmol/L姜黄素处理24 h;B组为时间组,即用60 μmol/L姜黄素处理12 h、24 h、48 h。

1.3 CCK-8法检测细胞抑制率

细胞活性计数试剂盒CCK8 (Cell Counting Kit 8)源自日本。将细胞培养处于对数生长期的MCF-7细胞用0.25%胰蛋白酶消化离心，并调整细胞株密度至8×104个细胞/ml，接种于96孔板中，培养24 h待细胞贴壁后弃去培养液，并加入用培液稀释的0、15、30、60、120 μmol/L姜黄素，每组设4个平行孔,100 nl/L每孔，每孔终体积为200 μl。继续作用培养24 h、48 h后，照试剂盒说明书更换培养液(加入CCK-8试剂，放在37 ℃培养箱中共同孵育4 h)；分别对作用24 h、48 h后的培养液用自动酶标仪测定450 nm波长处各孔的吸光度(OD)值，重复3次实验，并计算细胞抑制率。并根据细胞存活率对药物剂量对数作图求出IC50值。

细胞抑制率=(OD对照组-OD实验组)/OD对照组×100%

1.4 Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术(FCM)检测MCF-7细胞的诱导凋亡及细胞周期

加姜黄素12 h、24 h、48 h后以0.25%胰蛋白酶消化收集MCF-7细胞，按照Annexin V-FITC/PI双染流式细胞术(FCM)说明(bender公司)操作,取出295 μl细胞悬液加入5 μlAnnexin V-FITC混匀并且室温放置10 min。用PBS洗涤细胞2次并重新加入290 nl/L的Binding缓冲液以重悬细胞，并加入10 nl/L 的10 μg/ml的PI (Propidium Iodide)，轻轻混匀，4 ℃避光反应15 min，加入200 nl/L预冷的IX混合缓冲液中，混匀后立即上机检测。使用 guava 微流式细胞分析仪Nexin程序进行细胞凋亡率的检测，测定细胞数为 10 000个，重复3次实验。

1.5 Western Blot 法检测蛋白表达

取对数生长期人乳腺癌MCF-7细胞并接种于6孔培养板，在分别用0、15、30、60、120 μmol/L姜黄素处理细胞培养箱培养48 h后收集细胞后，RIPA裂解细胞提取细胞总蛋白，配胶，高温变性。将变性的蛋白以80 μg/30 μL 每孔上样进行SDS-PAGE 电泳，电泳后转膜至PVDF，5%脱脂牛奶封闭2 h。结合适当浓度的一抗4 ℃冰箱过夜后充分清洗，再分别与对应的 HRP 标记的二抗室温孵育2 h，显色采用eECL法，数据采集与分析采用OmegaLum G成像系统。重复3次实验。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 不同浓度姜黄素对MCF-7 细胞增殖的影响

15、30、60、120 μmol/L姜黄素在不同时间点的细

胞抑制率比较差异均有统计学意义(F=4.080,P=0.036;F=7.358,P=0.027;F=9.636,P=0.001;F=13.441,P≤0.001)，两两比较显示呈明显时间依赖性；同一时间点，15、30、60、120 μmol/L姜黄素的细胞抑制率比较差异均有统计学意义(F=5.981,P=0.022;F=10.080,P<0.001;F=14.650,P<0.001)，两两比较显示呈明显剂量依赖性，见表1。另外，不同浓度姜黄素作用于MCF-7细胞48 h后，姜黄素生物活性(IC50)测定为21.6 μmol/L。

表1 不同浓度姜黄素的MCF-7 细胞抑制率

注：a为与对照组比较,P<0.05;b为与15 μmol/L比较，P<0.05;c为与30 μmol/L比较,P<0.05;d为与60 μmol/L比较,P<0.05。1为与姜黄素组12 h比较,P<0.05;2为与姜黄素组24 h比较,P<0.05。

2.2 不同浓度姜黄素对 MCF-7 细胞凋亡的影响

MCF-7细胞培养24 h后(A组),0、15、30、60、120μmol/L姜黄素组凋亡率分别为0.87%、5.21%、7.80%、19.45%、30.31%，差异均有统计学意义(P<0.001)；细胞周期分布显示姜黄素浓度越高G1/S期细胞增加越多(P<0.001)，见表2。加入60 μmol/L姜黄素培养12 h、24 h、48 h后的凋亡率分别为6.89%、19.45%、22.12%，差异均有统计学意义(P<0.001)，显示姜黄素作用时间越长使得G1/S期细胞增多越明显(P<0.05)。具体结果见表3。

表2 不同浓度姜黄素对MCF27细胞周期和 凋亡率的检测结果/%

注：a为与对照组比较,P<0.05;b为与15 μmol/L比较，P<0.05;c为与30 μmol/L比较,P<0.05;d为与60 μmol/L比较,P<0.05。

表3 不同作用时间MCF-7细胞周期和凋亡情况/%

注：1为与姜黄素组12 h比较,P<0.05;2为与姜黄素组24 h比较,P<0.05。

2.3 姜黄素对Wnt通路相关蛋白(Wnt1、β-catenin)表达的影响

MCF-7细胞培养24 h后(A组),0、15、30、60、120 μmol/L姜黄素组的Wnt1、β-catenin蛋白表达量的差异均有统计学意义(P均<0.05)；加入60 μmol/L姜黄素培养12 h、24 h、48 h后的Wnt1、β-catenin蛋白表达量的差异均有统计学意义(P均<0.05)。具体见表4。

2.4 Wnt通路相关蛋白表达与MCF-7细胞的抑制、周期及凋亡的相关性

通过对A、B两组的24次的检测结果进行相关性分析，结果显示：细胞抑制率、G0/G1期细胞百分比、细胞凋亡率均与Wnt 通路相关蛋白Wnt1、β-catenin的表达呈明显相关性(P<0.05)，提示Wnt 通路在姜黄素诱导MCF-7细胞增殖抑制及凋亡过程中具有重要作用。具体见表5。

表4 乳腺癌细胞中Wnt1、β-catenin的蛋白 表达量

注：a为与对照组比较,P<0.05;b为与15μmol/L比较，P<0.05;c为与30 μmol/L比较,P<0.05;d为与60 μmol/L比较,P<0.05。1为与姜黄素组12 h比较,P<0.05。

表5 Wnt通路相关蛋白表达与细胞凋亡的相关性(n=24)

3 讨论

对于预后较差的乳腺癌，多重耐药与复发一直存在，仅依靠外科手术难以根治，多采取集手术、化放疗、内分泌治疗、生物治疗、物理康复治疗和中医中药治疗等多种治疗方式于一体的综合手段，以提高乳腺癌的治愈率及生存率。因此，积极探索新的治疗领域是乳腺癌治疗研究的热点，包括中医药治疗。既往大量细胞及动物实验均证明，姜黄素具明显的抗突变、抗肿瘤的生物活性，且抗癌谱较广、毒副作用小,应用前景广泛[6]。Wnt信号是一参与人体细胞多种复杂的生化反应的调节通路，近年来许多研究指出其余多种恶性肿瘤的发生发展中发挥重要作用，针对与乳腺癌等的研究也较多，均指出乳腺癌组织中存在着异常 Wnt通路，导致乳腺癌的发生和发展[7]。但目前对于Wnt信号通路在姜黄素诱导乳腺癌细胞凋亡中如何发挥作用尚待不确切。

本研究中经姜黄素作用过的MCF-7细胞出现了显著的细胞抑制及凋亡反应，且表现出明显的剂量与时间依赖性，作用剂量越大、作用时间越长，抗癌活性越高，抗增殖能力及杀伤能力就越强。从细胞周期分布来看,姜黄素使MCF-7细胞阻滞在G0/S期，无法进入下一增殖周期。正常情况下细胞周期阻滞时，细胞能够通过自我修复、开启细胞凋亡系统，受损细胞凋亡。而在肿瘤细胞中无法实现自我修复，从而出现细胞失控、无限增殖的现象。姜黄素是一种可以抑制细胞的增殖的TPK 抑制剂，且能够诱导细胞发生停滞在G0/S期，因而促进细胞发生凋亡。这一结果提示姜黄素抑制细胞增殖发挥抗肿瘤作用的机制之一是通过影响细胞周期分布，引起细胞代谢紊乱,导致细胞重新分化进行的，这与相关研究结果一致[8-10]。

Wnt通路的功能障碍异常、Wnt信号激活或细胞，导致β-catenin水平失控是肿瘤发生的重要原因。因此，抗肿瘤是从封闭异常活化的Wnt 信号通路入手，达到诱导细胞凋亡、抑制肿瘤细胞增殖的目的，甚至已经有人尝试以该通路为靶点来进行肿瘤治疗尝试[11]。Wnt1 蛋白是由 Wnt 基因编码的分泌糖蛋白，是Wnt 通路的组成部分，主要通过其下游的DSH 、β-catenin、APC 等去磷酸化和磷酸化过程来完成 Wnt 信号传递。Wieczorek M 等人就曾通过阻断Wnt-1 信号达到了诱导人乳腺癌细胞 MCF-7 细胞凋亡的目的[12]。β-catenin是Wnt通路的经典信号，可进入细胞核并堆积在核内，引起肿瘤的发生。本研究姜黄素作用于 MCF-7 细胞24 h后，Wnt1、β-catenin随着姜黄素剂量的增加其蛋白表达量越低；同在60 um/L姜黄素作用12 h、24 h、48 h的Wnt1、β-catenin的蛋白表达量呈现逐渐降低的趋势。提示姜黄素抑制乳腺癌细胞增殖抑制与凋亡可能与Wnt通路的调控有关。进一步的相关性分析显示细胞抑制率、细胞周期分布、细胞凋亡均与Wnt1、β-catenin的表达呈现较明显的相关性(P<0.05)。因此，本研究的结果可以说明姜黄素诱导乳腺癌MCF-7 细胞凋亡可能由于影响了经典的 Wnt/β-catenin途径引起的。正常状态下细胞胞质内游离 β-catenin 浓度处于相对较低水平，β-catenin失控造成肿瘤发生。姜黄素后能够封闭异常活化的Wnt 信号，有效降低β-catenin 水平及与Wnt相关的其他蛋白。但是Wnt 基因激活的原因尚不清楚，如果我们想把Wnt 信号通路与治疗靶点联系起来，尚缺乏足够的证据。且肿瘤细胞与多条信号通路交织复杂，我们还需要考虑各条信号通路之间的交互作用，展开进一步的研究。

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(编辑：吴小红)

Role of Wnt Signaling Pathway in Curcumin-induced Apoptosis of Breast Cancer Cells MCF-7

ZHAOYifeng,YANGYongjiang,WANGXiaoyuan,etal.

FirstAffiliatedHospitalofHebeiNorthUniversity,Zhangjiakou,075061

Objective To investigate the mechanism of Wnt pathway in curcumin-induced apoptosis of human breast cancer cells MCF-7.Methods The MCF-7 cells were randomly divided into 5 groups,respectively received 15,30,60 and 120μmol/L curcumin,and the control group,CCK-8 cells were cultured for 12,24 and 48 hours to detect proliferative capacity.Apoptosis and cell cycle distribution were observed by Annexin V-FITC/PI double staining flow cytometry (FCM).The Wnt pathway of group A and group B was detected by western blotting method.And to explore the relationship between the Wnt pathway and the apoptosis of breast cancer MCF-7 cells.Results CCK-8 showed that the proliferation inhibition rate of MCF-7 cells increased gradually with the increase of curcumin concentration (P<0.05);at the same time point,with the increase of curcumin concentration,the inhibition of cell proliferation (P<0.05).FCM staining showed that the apoptotic index of MCF-7 cells increased gradually with the increase of curcumin concentration (P<0.05) and the increase of G1/S phase cells (P<0.05).Western blotting results showed that the expression of Wnt1 and β-catenin in MCF-7 cells was dose and time dependent (P<0.05).The correlation analysis showed that the percentage of cells,G0/G1phase, apoptosis rate were closely correlated with the expression of Wnt1 and β-catenin (P<0.05).Conclusion The anticancer activity and antiproliferative ability of curcumin have a dose and time dependent manner,and Wnt pathway has a significant effect on the expression of Wnt1 and β-catenin in curcumin-induced breast cancer MCF-7 cells,and it plays an important role in the process of apoptosis.

Wnt signaling pathway;Curcumin;MCF-7 cells;Apoptosis

河北省卫生厅科研基金项目(编号：20150468)

075061 河北北方学院附属第一医院

梁晚平

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.02.005

R737.9

A

1001-5930(2017)02-0188-04

2016-12-12

2017-01-12)