基于色谱/质谱联用技术的代谢组学在卵巢癌研究中的应用

狄晓鸿，常子倩，马 萍*

（1.甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050；2.火箭军总医院，北京 100088）

基于色谱/质谱联用技术的代谢组学在卵巢癌研究中的应用

狄晓鸿1，常子倩2，马 萍2*

（1.甘肃省肿瘤医院，甘肃 兰州 730050；2.火箭军总医院，北京 100088）

卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，致死率居妇科恶性肿瘤首位。代谢组学是近年发展起来的对某一生物或细胞所有低分子量代谢产物进行定性和定量分析的新学科。人体任何的生理或病理改变都可由代谢表型反映，因此，卵巢癌发生发展中表现出的代谢变化规律必然可由代谢组学研究测定，以获得系统性、整体性、动态性信息，为卵巢癌早期诊断、合理治疗提供理论依据。色谱/质谱联用技术的发展极大地影响了代谢组学研究，目前已成为广泛应用且功能强大的分析工具。本文综述近几年有关色谱/质谱联用技术在卵巢癌代谢组学中应用的研究成果。

代谢组学；色谱/质谱联用技术；卵巢癌

1 代谢组学与医学研究

代谢组学是近年来在系统生物学蓬勃发展背景下出现的一门新兴学科，主要是利用高通量的化学分析技术及化学计量方法，对生物体内不同的病理、生理或生长状况下的代谢组进行动态分析，通过反映整体的代谢指纹图谱监测体内代谢网络的运行状态、诊断疾病、评价疗效、预测人体健康发展趋势。代谢组用于表示代谢物整体，即一个细胞、组织或器官中所有代谢物组分的集合，包括生化反应的中间产物和终产物，主要是一些相对分子质量为800～1 000×103的不同化学类型的小分子物质[1，2]。

机体的正常生理活动依赖于循环、泌尿等系统的平衡发展，当这种平衡因外源性或内源性因素发生改变时，就会出现代谢水平紊乱，若紊乱达到一定程度，就会出现细胞乃至组织水平的宏观变异，最终发生病理性改变。体内发生的代谢紊乱往往会在尿液和血液等体液代谢组中体现，因此，对尿液和血液等体液的代谢组进行检测分析，就有可能对疾病发生发展过程中出现的生物化学变化进行了解与认识，发现相关疾病的早期代谢组标志物，认识其分子机理[3]。因此，代谢组学在肿瘤相关研究方面日益凸显出无法比拟的优势。

2 代谢组学研究方法与色谱/质谱联用技术

代谢组学研究主要包括以下几个步骤：样本收集与制备，样本检测与数据获得和处理，生物统计学分析与数据阐释。

代谢组学研究最先且最关键的步骤是样本的收集、储存和预处理。血液及其衍生物和尿液因容易获得极大的量成为研究中最常用的样本，另外，唾液、呼吸浓缩物、支气管洗涤物、胰液、前列腺液、排泄物和其他类型的生物体液或者替代组织都可以用于代谢组学研究。对于不同的生物体液，大多数分析模型的标准样本量要求为0.1～0.5 ml[4]。

代谢组学研究的核心技术是核磁共振技术（NMR）和质谱技术（MS），现有的分析方法基本归为3类：磁共振波谱法、色谱/质谱联用方法和色谱/核磁/质谱联用方法。相对于NMR，MS的优势是具有很高的灵敏度和专属性，但是MS要求代谢成分预先分离，这就需要与色谱技术联用，包括气相色谱（GC）和液相色谱（LC），其中高效液相色谱（HPLC）更常用。NMR可以提供分子结构及化合物浓度的详细信息，但是其敏感度比MS低，通常需要大量样本，而且使用NMR检测的样本常不经过预先分离，每一个代谢成分的信号均显示出来，以至于信号复杂冗长。色谱/质谱联用技术的发展极大地影响了包括代谢组学在内的生物学研究，已成为广泛应用于代谢组学研究且功能强大的分析工具[5，6]。

代谢组学研究的最后一步是数据的分析与阐释，包括计算及生物信息的处理。为了进行成分识别和定量分析，获得的MS或NMR数据需要进行标准化处理及多变量统计分析。经过处理的数据能够被代谢组学数据库识别，这些数据库有Human Metabolome Database（HMDB）、METLIN、Golmdatabase、MassBank、Hpid Maps等。多变量统计分析方法包括监督的和非监督的学习方法，监督的学习方法如偏最小二乘法——判别分析（PLS-DA）、基于正交信号校正的偏最小方差——判别分析（OPLS-DA）、人工神经网络（ANN）、支持向量机（SVM）等通过建立模型来对样本进行分析，非监督的学习方法如主成分分析法（PCA）、层次聚类分析（HCA）、非线性映射（NLM）等将得到的分类信息与数据原始信息进行比较，建立代谢产物与原始数据的关系。其中，PCA和PLS-DA是目前代谢组学研究中普遍使用的多变量统计分析方法[4]。

3 色谱/质谱联用技术在卵巢癌代谢组学中的应用研究

卵巢癌是女性生殖系统常见的三大恶性肿瘤之一，由于卵巢位于盆腔深部，早期病变不易发现，出现腹胀、排便困难等症状时往往已属晚期，缺乏有效的治疗手段，因此卵巢癌死亡率居妇科肿瘤首位，且5年生存率低[7]。目前，女性生殖系统恶性肿瘤的诊断主要依赖于典型症状和筛查试验，如妇科检查、经阴道超声检查及肿瘤标记物筛查，这些检查及肿瘤标记物筛查灵敏度都不高且不具有特异性。如临床上CA125是最常用的生物标记物，但其并不在所有的卵巢癌患者尤其是早期患者中高表达，而且CA125在其他肿瘤及妇科良性疾病中也会高表达，对卵巢癌特异性不强。因此，寻找早期诊断卵巢癌的方法或标记物，确定肿瘤分型、分期及预后评估仍然是研究重点。

3.1 在卵巢癌诊断方面的研究

有文献[8]使用GC-MS、LC-MS联合PLS-DA对10例乳腺癌、9例卵巢癌、12例宫颈癌患者和22例正常人的尿液标本进行对照检测。先用非目标的定性分析得到样本的代谢模式，再用目标的定量分析对激素代谢物进行检测。对于卵巢癌，研究发现3种潜在的生物标记物：1-甲基腺苷、3-甲基尿嘧啶核苷、4-雄甾烯-3，17-二酮。这3种代谢物的水平在卵巢癌患者尿液标本中显著升高，并且均与DNA甲基化高度相关。提示代谢组学研究不仅可作为疾病诊断和患者分层的工具，还可通过代谢网络反映疾病状态。

Chen J等[9]分两步筛选和验证新的上皮性卵巢癌（EOC）代谢标记物。第一步是筛选，该研究使用基于非目标代谢组学的LC-MS技术，分析了27例正常女性、28例良性卵巢肿瘤患者和29例EOC患者的血清标本，通过OPLS-DA分析模型对3组进行区分，其中27-非-5β-胆甾-3，7，12，24，25-五醇葡糖苷酸（27-nor-5β-cholestane-3，7，12，24，25pentolglucuronide，CPG）、苯丙氨酸、甘氨胆酸、二乙酮肉碱、苯丙氨酸-苯丙氨酸二肽和聚碳酸酯6种代谢物被挑选出来作为潜在的待选生物标记物。第二步是验证，对另外685份来自不同临床背景的血清样本使用基于目标代谢组学的LC-MS分析。结果显示，CPG为潜在的生物标记物，在EOC患者血清中的含量高于良性卵巢肿瘤患者（P=0.001），同时，CPG在早期EOC（stage I）和3种组织类型的EOC患者血清中的含量均升高。所以，CPG可作为CA125的补充，即统计学相关的生物标记物，用于早期EOC检查。

武振宇等[10]对37例卵巢癌和51例非卵巢癌患者的尿液样本应用HPLC-MS进行分析，得到23 447个代谢组分，采用分类决策树作为基础算法，应用Boosting方法建模得到排序靠前的10个差异代谢组分，将卵巢癌患者与对照组患者进行很好的判别分类，其ROC曲线下面积达到0.944。张涛等[11]应用超高效液相色谱/飞行时间质谱技术（UPLC-TOF/MS），从卵巢癌及卵巢良性肿瘤患者血浆中分离出535种代谢物，联合应用PLS-DA进行分析，并通过与数据库对比，筛选出3种代谢物，分别是L-色氨酸、哌啶酮、溶血磷脂酰胆碱。这些代谢物将可能作为新的肿瘤标志物，为卵巢癌诊断提供依据。

Guan W等[12]研究了对卵巢癌及良性卵巢肿瘤患者血清代谢组学数据自动分类的新方法，评价了使用SVM对代谢数据进行分类的效果，该数据是为了识别潜在代谢性诊断标记物的组合，通过HPLC/TOF MS分析37例卵巢癌及35例良性卵巢肿瘤患者的血清标本而获得的。该研究通过评价选定的代谢物组合区分卵巢癌和良性卵巢肿瘤样本的能力，使用3种方法对SVM模型进行验证。综合的统计学显著性检验显示，区分血清样本的准确率达90%，提示该方法可能成为基于代谢组学的准确可信的卵巢癌检查手段。

3.2 在卵巢癌临床分型分期方面的研究

Denkert等[13]首次应用气相/飞行时间质谱技术（GC-TOF MS）分析了66例侵袭性卵巢癌和9例交界性卵巢肿瘤的代谢物谱，发现其主要区别是嘌呤、嘧啶代谢、糖脂以及能量代谢，通过聚类、主成分分析以及分类预测模型区分两种类型肿瘤的准确率达90%。

郝秀玉[14]利用HPLC-MS及PCA、PLS-DA对56例原发性上皮性卵巢癌患者尿液进行分析，发现8种在卵巢癌患者尿液中含量增加并且能够区别健康人和不同临床分期卵巢癌患者代谢状态的代谢物，分别是N-乙酰神经氨酸-9-磷酸、5-甲硫腺苷、尿酸-3-核苷、假尿嘧啶核苷、L-缬氨酸、琥珀酸、L-脯氨酸及β-烟酰胺单核苷酸。单因素方差分析显示，这8种潜在的生物标记物在健康人和不同临床分期卵巢癌患者尿液中水平不同，而且随着病情的发展，多数呈现逐渐增高趋势。其中N-乙酰神经氨酸-9-磷酸和假尿嘧啶核苷水平增高趋势典型并且规律，不但在健康人和卵巢癌患者尿液中明显不同，而且在处于不同临床分期的卵巢癌患者尿液中也存在明显差异，因而对卵巢癌患者早期诊断及临床分期可能更具有价值。

3.3 在卵巢癌其他方面的应用研究

崔广波等[15]采用基于GC-MS代谢组学技术研究人体卵巢癌紫杉醇耐药细胞A2780/Taxol与敏感细胞之间内源性代谢物的差异，初步探讨了A2780/Taxol细胞生物学特性和耐药机制。研究使用浓度梯度法建立A2780/Taxol细胞，并通过细胞形态观察，生长曲线测定，药物敏感试验，细胞内多药耐药相关蛋白（MRP1）、P-糖蛋白（P-gP）和肺耐药蛋白（LRP）水平测定，评价A2780/Taxol细胞的生物学特性。同时，采用GC-MS代谢组学方法分别对卵巢癌敏感细胞株与紫杉醇耐药细胞株的代谢物指纹图谱进行分析，并通过PLS-DA对代谢组学数据进行多元处理。研究结果表明，人卵巢癌敏感细胞与耐药细胞的琥珀酸、天冬氨酸、果糖、肌醇等13种内源性代谢物存在显著性差异，糖降解、三羧酸（TCA）循环、肌苷代谢途径发生了异常改变，而这可能与卵巢癌细胞的耐药机制有关。

总之，卵巢癌的发生发展是一个与代谢相关的过程，通过代谢组学研究能探索肿瘤在发生发展过程中的代谢改变，发现可用于卵巢癌早期预警、诊断、评估和预后的新的标记物。

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（*通讯作者：马萍）

R737.31

A

1671－1246（2017）15－0150－03