人精子相互作用蛋白的研究进展▲

申树林

(广西医科大学第一附属医院男性科，南宁市 530021)

·综 述·

人精子相互作用蛋白的研究进展▲

申树林

(广西医科大学第一附属医院男性科，南宁市 530021)

生物体内绝大多数蛋白质不是单独发挥作用，而是以复合体(蛋白质相互作用)形式发挥某种生物学功能，人精子蛋白质也不例外。近年来，一些研究者在人精子发生的蛋白质相互作用、精子运动蛋白质相互作用和受精相关的蛋白质相互作用研究方面进行了卓有成效的探索，并取得了令人振奋的成果。这些成果对男性不育的病因、发病机制和男性避孕等研究有重要意义。

精子；蛋白质；相互作用

随着精子蛋白质组学研究的深入，人们发现蛋白质大多数是以复合体(蛋白质相互作用)形式发挥某种生物学功能，只有对复合体组分进行深入研究，才能清楚各个蛋白质的功能。近年来，一些学者在人精子蛋白相互作用方面进行了卓有成效的探索，并取得了令人振奋的成果，本文将对这些研究综述如下。

1 精子发生的相互作用蛋白研究

精子的发生要经过三个阶段才能成为成熟的精子细胞，即精原干细胞增殖分化、精母细胞减数分裂和精子形成。这些阶段均是在许多基因和蛋白质的调控下进行的，当然，蛋白质复合体(即相互作用蛋白)起到至关重要的作用。若此过程受到干扰，就会使精子生成障碍而导致无精子症、少精症、弱精症、畸形精子症等，引起男性不育。

精子形成首先是精原干细胞进行增殖分化和有丝分裂，有学者在此方面进行了研究。其方法是运用CytoTrap®XR酵母双杂交系统筛选人睾丸HSD-4的cDNA文库和蛋白质表达，实验验证HSD-4蛋白与MAFB蛋白质有相互作用。MAFB主要分布于细胞核，在许多细胞分化和组织形成过程中起着重要作用[1]，表明HSD-4可能在精原细胞的增殖分化中发挥重要作用。另有研究发现了一个人类睾丸特异性表达新基因-HMGB4，该基因在小鼠粗线期精母细胞开始表达并增加直至圆形精子细胞形成，在成熟的附睾精子中并没有表达。免疫共沉淀技术结合质谱方法筛选和鉴定出丙酮酸脱氢Ela亚单位(PDHAI)与HMGB4蛋白结合。PDHAI属于丙酮酸脱氢酶系中的成员，催化丙酮酸脱羧反应。HMGB4可能是一个潜在的转录抑制子[2]，HMGB4和PDHAI蛋白相互作用可能在精原细胞的分化和分裂中发挥某种作用。生精细胞的凋亡在保持精子生成数量方面扮演重要作用。PIAS(protein inhibitor of activated，STAT)蛋白家族有四个成员:PIASI、PIAS2、PIAS3和PIASy，其中PIAS2又有两个亚型PIASxa和PIAS2，均在人睾丸组织中特异表达。研究发现RACK1与PIAS2有相互作用，相互作用的关键区域为RACK1的WD5-WD7结构域，二者共定位于细胞中，说明RACK1蛋白是一个新的相互作用蛋白。敲除PIAS2基因后睾丸生成精子数量减少，细胞凋亡增加，表明PIAS2与RACK1复合体可能通过细胞凋亡途径影响精子的形成[3]。

减数分裂是精子细胞形成中的特有现象，如果出现异常就会导致睾丸生精功能障碍。研究发现MLH1缺失导致精母细胞粗线期停滞，表明MLH1在精子发生中具有重要作用。殷毅等[4]采用酵母双杂交系统筛选出了可能与 MLH1有相互作用的蛋白RHNO1，然后采用免疫共沉淀和GST pull-down技术验证二者有相互作用，由此表明MLH1与RHNO1复合体蛋白参与了精子形成中的减数分裂和同源重组。GGNl在生殖细胞发育的减数分裂前后表达，通过酵母双杂交实验和免疫共沉淀技术证实GGNBP2与GGNl有相互作用。GGNBP2在睾丸、初级精母细胞和减数分裂时期[5]均有表达，但在圆形精细胞中无表达。GGNl和GGNBP2为相互作用蛋白，并且在减数分裂阶段都有表达，提示他们在减数分裂中起重要作用。

精子形成是指精子细胞由圆形变成如同蝌蚪样的成熟精子。RSB66是一个新发现的基因，该基因编码含168个氨基酸残基的多肽链。采用酵母双杂交系统和Western Blot等方法研究发现RSB66与HSD45有相互作用，体内外实验均得到确证蛋白激酶CK2属于信使非依赖性丝氨酸或苏氨酸蛋白激酶，普遍存在于真核细胞中，在细胞信号转导、细胞增殖和分化等方面发挥重要作用。敲除实验小鼠CK2基因，引起精子生成减少和圆头精子，导致实验小鼠不育，此现象与人圆头精子相似。利用酵母双杂交系统筛选和验证转换蛋白1(TPI) 与CK2有相互作用，实验结果对研究人圆头精子的发生有重要意义[7]。

精子形成也是在一系列信号转导分子的调控下实现的，FAM3A(family with sequence similarity)是细胞因子FAM3家族成员之一。研究者运用酵母双杂交等技术和方法，筛选并验证了苏氨酸激酶(TSSK4)与FAM3有相互作用。TSSK4与FAM3在睾丸圆形精子表达，而TSSK4是一种磷酸化激酶，可能通过蛋白质磷酸化在精子形成的信号转导中发挥作用[8]。

2 与精子运动有关的相互作用蛋白研究

精子的运动能力对于自然受精至关重要，众多的研究已经证明精子的运动能力是在附睾获得的。Eppin基因特异性在睾丸和附睾表达，Eppin蛋白通过调控精液的凝固和液化过程，影响精子的获能和运动。进一步研究发现，精囊分泌的纤维连接蛋白Fibronectin与Eppin特异性结合，可能的机制是在射精过程中，附睾精子通过射精管时与精囊分泌液中的Fibronectin发生相互作用[9]。另有研究将重组Eppin (rEppin)和重组精囊凝固蛋白Semenogelin (rSg)共同孵育，免疫共沉淀和Western验证rEppin与rSg有相互作用。Eppin与Sg发生特异性结合，是通过Sg分子结构中的半胱氨酸残基Cys-239结合位点实现的，如果Cys-239还原及羧甲基化将阻碍rEppin与rSg的结合[10]。还有研究者运用质谱、免疫沉淀和Western blots技术从人精液Eppin蛋白复合体中鉴定出了lactotransferrin、clusterin、 semenogelin三个蛋白，三者共定位于精子尾部[11]。有研究鉴定EPPIN复合体中相互作用蛋白EPPIN′s的氨基酸序列，EPPIN′s序列C102-P133包含与semenogelin结合的主要位点。在相同区域序列F117-P133结合EPPIN复合体相关蛋白lactotransferrin (LTF)，表明在EPPIN C-terminus的Cys102、Tyr107、Phe117对于SEMG1结合是必需的[12]。蛋白质相互作用的鉴定对于完全理解生物学过程和相关生化通路蛋白的功能是至关重要的。Tomar等[13]运用免疫共沉淀、SDS-PAGE和质谱法对人精浆泌乳素诱导蛋白(PIP)相互作用蛋白进行研究，三个相互作用蛋白被鉴定，分别是人类血清白蛋白，zinc-α-2糖蛋白和semenogelin I，这是第一次报告人类精浆中的PIP和semenogelin之间有相互作用，这对精子的获得运动能力的研究有帮助。

精子的能量代谢对其运动同样重要，研究发现DNAJBl3在人类睾丸组织中高表达，定位于成熟精子尾部鞭毛中段放射轴、外侧微管、外周致密纤维以及线粒体，提示其功能与精子运动相关。突变筛查研究结果提示其功能与人类特发性弱精症相关。采用免疫共沉淀方法联合质谱分析筛查DNAJBl3在人成熟精子中相互作用的蛋白，提示其作用机制可能是通过与HKI和LDHC的相互作用，参与成熟精子的糖代谢过程从而影响精子的运动[14]。

精子膜蛋白既是精子的重要组成成分，又是许多受体与相应的配体特异性结合调节精子运动的作用靶点，酵母双杂交和pull-down实验验证YWK-II蛋白与MIS有相互作用。研究表明人精子单跨膜蛋白YWK-II可能是MIS的作用受体，二者的结合可能对精子的运动及生存力起重要作用[15]。另一方面精子膜通透性和一些钙调蛋白通过调节钾、钙等离子的浓度而调控精子的运动，如睾丸特异性钙结合蛋白CBP 86-IV和Tecktin 4。申树林等[16]采用蛋白质组技术在研究特发性弱精子症患者精子蛋白质组学鉴定的蛋白质，为了研究这两种蛋白的功能，我们用免疫共沉淀技术，以Tektin 4抗体为诱饵从人精子总蛋白中钓取Tektin 4复合体，并对复合体进行质谱鉴定， 发现了semenogelin I、semenogelin-1 preproprotein和semenogelin II三个蛋白。由此表明Tektin 4和semenogelin蛋白复合体(也称为相互作用蛋白)在精子运动中发挥重要作用。另外用克隆技术获得睾丸特异性钙结合蛋白CBP86-IV的编码基因，构建融合基因表达载体并进行重组蛋白表达，采用串联亲和纯化技术和免疫共沉淀法分离出TS-CBP86-IV蛋白复合体，再用质谱鉴定出可能与其相互作用的蛋白质12个，数据库检索发现部分蛋白参与精子运动调控[17]。

3 受精相关蛋白质的相互作用蛋白研究

精卵融合，也称为受精，整个受精过程包括精子与卵子识别、精子穿透透明带、卵子激活和精卵核融合。从分子水平上阐明精卵相互作用在有性生殖领域是一个尚未解决的问题。研究者利用蛋白质相互作用网络方法揭示精卵融合可能的蛋白质相互作用和相关的分子功能。构建网络显示新的相互作用：包括人卵细胞CD151、CD9与人精子CD49相互作用；精子的CD49、ITGA4、CD63分别于卵细胞的CD63和 CD81相互作用，也与卵子CD9发生相互作用[18]。通过分析网络，确定精-卵相互作用的主要分子功能，需要进一步的实验研究证实。Ezrin作为一种连接蛋白，将细胞膜和膜蛋白以及骨架蛋白等连接起来，从而形成或维持微绒毛和细胞膜突起等特殊结构。相反，如果抑制ezrin功能，将会影响细胞的这些结构。ezrin在细胞内的主要作用是调控细胞形态或者介导细胞与细胞、或细胞与基质之间的粘附等。研究发现ezrin分别与F-actin、RhoGDll、cd44有相互作用。通过实验结果分析及结合相关研究，王蕾[19]推测人精子获能过程中ezrin、RhoGDll、actin、RhoA及膜蛋白相互作用形成一个蛋白网络，调节获能过程中精子质膜重组和重新分布，从而影响精卵融合的复杂受精过程。受精过程也需要分子伴侣协同作用，分子伴侣HSPA2( molecular chaperone Heat Shock Protein A2，HSPA2)是透明带受体复合体组装中的关键调节因子，精子不能与缺乏HSPA2蛋白表达的卵子透明带发生相互作用。BAG6(BCL2-associated athanogene 6，BAG6)定位于非获能精子的赤道区域。研究发现BAG6与HSPA2共定位在人睾丸生殖细胞和附睾精子，蛋白质相互作用分析显示BAG6与HSPA2在成熟精子中保持稳定的相互作用。研究还发现不育男性精子透明带缺乏HSPA2以及BAG6表达。在人类生殖细胞，BAG6可能是HSPA2稳定/功能的一个关键调节器，表明BAG6可能是进一步研究男性特发性不育症的一个重要的候选蛋白[20]。

综上所述，研究精子相互作用蛋白不仅对揭示精子的发生、运动及受精过程的分子机制有重要意义，而且可为男性不育症的诊断、治疗和男性避孕等研究奠定重要基础。

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国家自然科学基金(编号：81260123)

Q 954.43+4

A

1673-6575(2017)04-0508-03

10.11864/j.issn.1673.2017.04.18

2016-12-28

2017-02-26)