固态发酵豆渣和苹果渣复合蛋白饲料的研究

罗 文，王晓力，朱新强，麻文姣，王永刚，孙启忠

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州 730050； 2.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050； 3.食品药品监督管理局，甘肃 民乐 734500； 4.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 7301091)

固态发酵豆渣和苹果渣复合蛋白饲料的研究

罗 文1,2，王晓力1，朱新强1，麻文姣3，王永刚2，孙启忠4

(1.中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所，甘肃 兰州 730050； 2.兰州理工大学生命科学与工程学院，甘肃 兰州 730050； 3.食品药品监督管理局，甘肃 民乐 734500； 4.中国农业科学院草原研究所，内蒙古 呼和浩特 7301091)

以豆渣、苹果渣为发酵基质，以酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉为发酵菌株，筛选出最佳菌种配比，探讨了不同接种量、时间、基质水分、温度对混合渣发酵生产饲料蛋白的影响。结果表明：酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉的配比为3∶2∶4，在接种量1%，培养48 h，基质含水量70%，发酵温度为30℃时，发酵产物中粗蛋白质的质量分数从15.87%提高到19.83%。

豆渣；苹果渣；微生物发酵；蛋白饲料

豆渣是生产豆奶、豆腐或腐竹等豆制品过程中的副产品。豆渣中含有极为丰富的营养物质[1]。我国是大豆生产大国，国内大豆食品行业每年约产生2 000万t左右的湿豆渣，但其利用率仅为4.96%～16.60%[2]。湿豆渣的含水量大，运输困难，又极易腐败变质，传统的豆渣处理方式对其的利用率较低。我国是世界上最大的苹果生产国，年产苹果达2 600万t以上，约占世界总产量的40%，苹果加工中每年排出苹果渣接近600万t[3]。目前，果渣除少量被用于饲料及深加工外，绝大部分被遗弃，不仅造成资源的浪费，而且严重污染环境，如何合理利用苹果渣类饲料资源一直是一个迫切需要解决的难题[4]。

豆渣作为一种具有开发价值的膳食纤维和蛋白质源[5-6]，将其作为发酵底物，利用微生物发酵生产动物饲料是一种良好的利用途径。近几年有很多关于豆渣发酵产动物饲料的报道，肖少香等[7]的研究表明：采用毛霉发酵豆渣后，豆渣中蛋白质得到有效分解，氨基酸态氮的含量由发酵期前的0.031%增至0.130%。李应琼[8]的研究显示采用放射毛霉和运动发酵单胞菌作为发酵剂对豆渣进行发酵后，可溶性粗蛋白质从1.99%上升至12.66%；不溶性纤维从47.42%下降至37.50%。发酵过程使豆渣的硬度、弹性、咀嚼性及回复性均有提高。苹果渣含有可溶性糖、维生素、矿物质及纤维素等丰富的营养物质，是良好的发酵底物。Joshi等[9]的研究结果表明，苹果废弃渣经固态发酵后可得到营养丰富的单细胞蛋白饲料。其中粗蛋白质含量提高了3倍，脂肪含量增加约2.0倍。武运等[10]以热带假丝酵母菌和啤酒酵母菌为菌剂，以苹果渣为底物进行固态发酵后粗蛋白质、粗脂肪等主要成分含量显著提高，营养价值增加，具有良好的饲用价值。

以豆渣和苹果渣同时作为底料进行固态发酵生产饲料未见报道。苹果渣中丰富的糖分和豆渣中丰富的氮源有利于菌体的快速生长，提高了发酵效率，同时采用酵母菌和霉菌的生长和代谢产酶，不仅使得豆渣和苹果渣中的纤维素降低，改善口感，同时能产生菌体蛋白和各种易于吸收的小分子物质，丰富混合料的营养成分。因此，本研究以豆渣和苹果渣为发酵底物，以酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉为发酵菌种，以提高发酵饲料中蛋白质为目标，探索发酵条件对豆渣混合苹果渣发酵饲料实验的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验原料

豆渣(兰州理工大学学校豆腐坊)、苹果渣(天水长城果汁集团有限公司)。

1.1.2 供试菌株

黑曲霉孢子粉(孢子含量≥150亿/g，沂源康源生物科技有限公司)、里氏木霉(纤维素酶酶活≥30 000 U/g)、酿酒酵母(水分≤6%，酵母活性细胞≥200亿/g)，购自武汉东康源科技有限公司。

1.1.3 培养基

PDA斜面培养基：马铃薯200 g ，去皮后切成小块，加水煮沸至软而不烂，用纱布过滤；加琼脂20 g，融化过滤后加葡萄糖20 g，磷酸二氢钾2 g，蛋白胨1 g，硫酸镁1 g，硫酸胺1 g，补水至1 000 ml，pH值调至7.2～7.4，分装在4 个500 ml 的锥形瓶中，121℃灭菌20 min，冷却待用。

PDA 种子液培养基：与配制上述PDA 斜面培养基的方法相同，但不加琼脂。

1.2 试剂与仪器

试剂：浓硫酸、浓盐酸、氢氧化钠、石油醚、丙酮、硼酸、甲基红、溴甲酚绿等均为分析纯，购自天津市富宇精细化工有限公司。

仪器：GZX-9240MBZ数显鼓风干燥箱、HPX-9162MBE数显电热培养箱、SHB-IIIA真空泵、DSX-280B灭菌锅、AB104-N电子分析天平、博兰特无菌操作台、Cary50紫外可见分光光度计等。

1.3 实验方法

1.3.1 固态发酵工艺流程

以豆渣和苹果渣为发酵基质，将酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉三种菌悬液接种活化后扩大培养至活菌/孢子数≥109，于超净台内用无菌玻璃棒将基质搅拌均匀，用pH6.0磷酸盐缓冲液调节发酵基质水分含量，按豆渣和苹果渣质量比为2∶1(前期实验中获得的结果)分装100 g于一次性餐盒中，在不同的发酵条件下发酵。发酵结束后，将发酵产物在60℃下干燥，测定粗蛋白质、中性纤维素和酸性纤维素含量。

1.3.2 单因素发酵实验

1.3.2.1 固态发酵复合菌种组合的确定

以豆渣和苹果渣(2∶1)为发酵基质，分别将活化后扩大培养的酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉三种菌悬液(活菌/孢子数≥109)以单独或不同组合方式，按1%的接种量接到发酵基质上，于超净台内用无菌玻璃棒将基质搅拌均匀，用pH6.0磷酸盐缓冲液调节发酵基质水分为60%，分装100 g于一次性餐盒中，在30℃条件下发酵3 d，发酵结束后，将发酵产物在60℃下干燥，测定粗蛋白质、中性纤维素和酸性纤维素含量，确定最佳的发酵菌种组合。

1.3.2.2 固态发酵复合菌种比例的确定

分别改变酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉的配比，接种发酵菌株参照1.3.2.1节方法进行发酵，测定粗蛋白质、中性纤维素和酸性纤维素含量，确定最佳的菌种的比例。

1.3.2.3 接种量的确定

将酿酒酵母，黑曲霉和里氏木霉的种子液按3∶2∶4比例混合，分别改变接种量，参照1.3.2.1节方法进行发酵，测定粗蛋白质、中性纤维素和酸性纤维素含量，确定最佳的接种量。

1.3.2.4 发酵时间的确定

分别改变发酵时间，接种发酵菌株参照1.3.2.1节方法进行发酵，测定粗蛋白质、中性纤维素和酸性纤维素含量，确定最佳的发酵时间。

1.3.2.5 初始水分含量的确定

分别改变初始发酵基质含水量，接种发酵菌株参照1.3.2.1节方法进行发酵，测定粗蛋白质、中性纤维素和酸性纤维素含量，确定最佳的初始含水量。

1.3.2.6 发酵温度的确定

分别改变发酵温度，接种发酵菌株参照1.3.2.1节方法进行发酵，测定粗蛋白质、中性纤维素和酸性纤维素含量，确定最佳的发酵时间。

1.3.3 正交实验

在单因素试验基础上，以发酵时间、水分和接种量为因素，采用L9(34)表做正交试验，以发酵饲料中粗蛋白质质量分数作为评价指标，正交试验因素与水平见表1。

表1 因素水平表

1.3.4 分析方法及发酵饲料质量评价

(1)微生物计数：采用血球计数板法对酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉细胞进行计数。

(2)饲料感官评定：根据发酵饲料的气味、色泽及质地评定饲料发酵状况的优劣。

(3)饲料基本成分测定：粗蛋白质(CP)含量采用GB/T6432-1994方法测定；粗纤维(CF)含量采用GB/T 6434-1994酸碱洗涤法测定；粗脂肪含量采用索氏提取法测定；灰分(Ash)测定采用GB/T 6438-1992中的灰化法；酸性洗涤纤维(ADF)含量参照NY/T 1459-2007方法测定；中性洗涤纤维素(NDF)含量参照GB/T 20806-2006方法测定。

1.3.5 统计学分析

数据平行测定3次，结果用“平均值±标准差”表示，采用SPSS 17.0进行方差分析和显著性分析。

2 结果与分析

2.1 发酵原料营养成分分析

参照国家标准测定方法分别对豆渣和苹果渣基本成分进行测定，结果如表2。

表2 发酵原料基本营养成分测定结果(以干基计)

由表2可见，2种原料中主要成分是蛋白质和纤维素，其中豆渣中的蛋白质和粗纤维含量均为最高。基质中含有的大量非水溶性纤维素类物质影响了各饲料原料的适口性。采用微生物发酵法通过降解基质中的纤维素类物质，不仅可以改善饲料原料的口感，还可以产生很多对动物消化吸收有利的代谢产物。

2.2 单因素实验结果

2.2.1 发酵菌株的选择

实验选择酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉为发酵菌株，参照1.3.2.1节方法以豆渣和苹果渣(2∶1)为发酵基质，按照总接种量为1.0%将三种菌种以单独或不同比例组合方式，发酵结束后测定饲料中粗蛋白质、粗纤维含量，并以不接种任何菌种为空白对照，结果见图1。

CK：空白；N：酿酒酵母；H：黑曲霉；L：里氏木霉

从图1可以看出，不同的菌种组合利用糟渣类物质的效率不同，与空白对照组相比，采用单菌发酵后的粗蛋白质质量分数提高了6%～15%，三种菌两两组合之后，粗蛋白质质量分数提高了10%～20%，而酿酒酵母+黑曲霉和酿酒酵母+里氏木霉组合较黑曲霉单独发酵产物的蛋白质质量分数略低，主要原因是总接种量为1%，单位体积中微生物菌体数量有差异，其中黑曲霉主要起到分泌纤维素降解酶作用，因此黑曲霉组中的纤维素酶活力较高，水解纤维素能力强，黑曲霉利用水解产物繁殖，菌体蛋白含量较其他两组略高，但差异不显著。三种菌同时混合后进行发酵，各种微生物分别分泌不同酶类，互补缺陷，能够利用更多的单糖进行繁殖，进而菌体蛋白相对较高，粗蛋白质的质量分数提高了25.32%左右，所以本次试验中最佳的菌种组合是三种发酵菌同时使用，这样保证了粗蛋白质的质量分数能达到最大。

2.2.2 发酵菌种组合比例的确定

菌种选定后，发酵的关键在于找到发酵菌种合适的比例。依据2.2.1发酵试验结果，确定酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉的三菌组合方式为优选菌种，固定酿酒酵母的接种量为1%，以豆渣和苹果渣(2∶1)为发酵基质，参照1.3.2.1节方法将黑曲霉与里氏木霉按不同比例混合，按总接种量3%接种，发酵结束后测定饲料中粗蛋白质、粗纤维含量，并以只接种酿酒酵母为空白对照，结果如图2。

由图2可见，不同的菌种组合较空白组发酵后。粗蛋白质质量分数提高了14.13%～27.12%，当黑曲霉与里氏木霉比例为1∶2时，粗蛋白质质量分数达到最大值(27.12%)。所以当酿酒酵母的接种量为1%时，黑曲霉与里氏木霉混合接种量为2%，其中黑曲霉与里氏木霉比例为1∶2，在此条件下粗蛋白质的质量分数达到最大。故得到酿酒酵母∶黑曲霉∶里氏木霉的比例为3∶2∶4。

图2 菌株(黑曲霉和里氏木霉)不同比例发酵产物粗蛋白质和纤维素质量分数

2.2.3 接种量的确定

接种量对于发酵过程中微生物的生长和代谢调控有着重要影响。我们分别采用接种量(体积分数)1%、3%、5%、7%和9% ，接种发酵48 h，发酵产物中粗蛋白质、中性纤维素和酸性纤维素质量分数见图3。

图3 接种量对发酵饲料蛋白质、酸性和中性洗涤纤维质量分数的影响

由图3可见，产物中蛋白质质量分数没有显著差异，接种量为1%的时候，ADF、NDF含量最低。当接种量过高时，菌体大量繁殖，基质产热过快，不利于发酵进行下去；同时基质的养料不能满足大量菌体的生长所需，随着发酵的进行，大部分可溶性养分被菌体利用后，酶分解底料所产生的养分，不足以满足菌体自身的需要，也会造成菌的早期衰亡。故最佳接种量选为1%。

2.2.4 初始水分的确定

微生物在发酵过程中需要有适宜的水分。发酵底物环境中的水分直接影响微生物的生长情况，随着含水量的增加，提高了反应体系的水活度，这不仅有利于菌体对营养物质的输送，也增加了菌株代谢产酶量的增加；但是当基质水分过高，通气性不好，不利于菌体的呼吸和散热，会刺激芽胞杆菌的发育，发生怪味，并分泌抑制物质，影响发酵菌种的生长，严重时会导致失败。参照1.3.2.1节方法分别进行初始基质水分为60%、65%、70%和75%的发酵实验，粗蛋白质、纤维素测定结果如图4。

图4 初始含水量对发酵饲料蛋白质、酸性和中性洗涤纤维质量分数的影响

由图4可见，初始水分为65% 时，所得到的饲料中粗蛋白质的含量最高，酸性洗涤纤维素和中性洗涤纤维素含量最低。因此确定发酵初始基质水分为65%。

2.2.5 发酵时间的确定

以酿酒酵母、黑曲霉和里氏木霉为发酵菌株(3∶2∶4)，豆渣和苹果渣(2∶1)为发酵基质，参照1.3.2.1节方法分别进行12、24、36、48、60 h发酵实验，发酵结束后饲料中粗蛋白质、酸性纤维素和中性纤维素含量测定结果见图5。

图5 发酵时间对发酵饲料蛋白质、酸性和中性洗涤纤维质量分数的影响

由图5可见，随着发酵时间的增加，饲料中蛋白质含量逐渐增加，酸性纤维素和中性纤维素逐渐降低。当发酵时间为48 h时，趋于稳定，所得到的饲料中粗蛋白质的含量很高，纤维素含量很低，说明随着发酵时间的增加，微生物能够利用基质中不溶性纤维素进行繁殖和代谢，蛋白质含量逐渐增加。故选用48 h为最佳发酵时间。

2.2.6 发酵温度的确定

温度是影响微生物生长和代谢活动的主要因素之一，菌体一般有最适的生长温度。温度过低会使菌体生长过慢，延长发酵周期；温度过高会造成菌体死亡，发酵无法进行。由于本次发酵菌株都属于真菌，因此分别在22、26、30、34、38℃五个温度下进行发酵，其他发酵参数同1.3.2.1。发酵结束后，饲料中蛋白质、中性纤维素和酸性纤维素含量见图6。

图6 发酵温度对发酵饲料蛋白质、酸性和中性洗涤纤维质量分数的影响

由图6可知，在30℃下饲料中蛋白质含量最高，酸性纤维素和中性纤维素含量最低，初步确定发酵温度为30℃，这样不仅能满足微生物生长代谢，也能满足发酵代谢中产生的各种酶类所需要的最适宜酶解温度。

2.3 正交试验

根据上述单因素实验结果，以酿酒酵母、黑曲霉、里氏木霉为发酵菌株(3∶2∶4)，豆渣和苹果渣(2∶1)为发酵基质，以粗蛋白质含量为评价指标分别研究发酵时间(A)、水分含量(B)、发酵温度(C)、接种量(D)四个因素对发酵饲料的影响。按照表1进行正交试验，结果见表3。

表3 正交试验粗蛋白质直观分析表

由表3可知，各因素对发酵产品蛋白质含量的影响程度依次为：发酵时间、发酵基质初始含水率、发酵接种量、发酵温度。而且发酵最优条件为A3B3C2D2。即：发酵时间为48 h，发酵基质初始含水率70%，发酵温度为30℃，接种量为1%。在此发酵条件下进一步对该组合进行验证试验，经测定发酵后饲料中粗蛋白质质量分数达19.83%，因此确定本组合为最佳发酵工艺条件。

3 结论

以复合基质为主要原料，利用混合菌株对原料进行协同处理得到新型生物蛋白饲料，对其最适菌种配伍和发酵参数进行优化，以确定最佳工艺参数，并对发酵产物的营养价值进行评定。

(1)菌种最佳的发酵组合为酿酒酵母+黑曲霉+里氏木霉；当三种菌以3∶2∶4 混合接入，发酵效果最好。最佳发酵工艺条件为：发酵时间为48 h，发酵基质初始含水率70%，发酵温度为30℃，接种量为1%。

(2)发酵后基质中蛋白质含量明显升高，由原来的 15.87%上升到 19.83%，增加率达到24.95%；较好的改善了单纯用豆腐渣或苹果渣发酵的不足。

[1] 王东玲,李 波,芦 菲,等.豆腐渣的营养成分分析[J].食品与发酵科技,2000,6(4)：85-87.

[2] 赵 影,韩建春,郑环宇,等.豆渣深加工及综合利用的研究现状[J].大豆科学,2013,32(4)：555-560.

[3] 施 笔.苹果渣的开发利用与喂畜效果[J].山西饲料,2010(5)：48-49.

[4] 石 勇,何 平,陈茂彬.果渣的开发利用研究[J].饲料工业,2007,28(1)：54-56.

[5] 袁翠林，于子洋，林英庭，等.苹果渣在反刍动物生产中的应用研究进展[J].粮食与饲料工业,2015(1):43-45.

[6] 宋 鹏，陈五岭.苹果渣发酵生产生物蛋白饲料工艺的研究[J].粮食与饲料工业,2011(2)：49-50.

[7] 肖少香.豆渣发酵技术的研究[J].食品科技,2007(7)：72-75.[8] 李应琼.霉豆渣混合发酵的研究[D].广州：华南理工大学,2011.

[9] JOSHI V K,SANDBU D K.Preparation and evaluation of an animal feed by product produced by solid-state fermentation of apple pomace[J].Bioresource Technology,1997,56(23)：251-255.

[10] 武 运,李焕荣,陶咏霞,等.发酵苹果渣生产菌体蛋白饲料工艺的研究[J].中国酿造，2009,202(1)：83-86.

(责任编辑：梅 竹)

Production of compound protein feedstuff from bean dregs and apple pomace by solid-state fermentation

LUO Wen1,2,WANG Xiao-li1,ZHU Xin-Qiang1,MA Wen-jiao3,WANG Yong-gang2,SUN Qi-zhong4

(1.Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS,Lanzhou 730050,China;2.School of Life Science and Engineering,Lanzhou University of Technology,Lanzhou 730050,China;3.Minle Food and Drug Administration,Minle 734500,China;4.Institute of Grassland Research of CAAS,Huhehaote 7301091,China)

SelectingSaccharomycescerevisiae,AspergillusnigerandTrichodermavirideas the fermentation strains,the fermentation conditions of producing compound protein feedstuff from bean dregs and apple pomace were studied.Results showed that the optimal conditions were as follows：the proportion ofSaccharomycescerevisiae,AspergillusnigerandTrichodermareeseiof 3∶2∶4,inoculum amount 1%,fermentation time 48 h， initial moisture content of culture media 70%,fermentation temperature 30℃.Under the conditions,the crude protein content increased from 15.87% to 19.83%.

bean dregs;apple pomace;solid state fermentation;protein feed

2016-11-05；

2017-01-09

公益性行业 (农业)科研专项(201403048-8和201203042)；甘肃省重大科研专项(2014GS00998)和甘肃省自然基金(1310RJYA022)项目资助。

罗 文(1990-)，男，硕士生，主要从事微生物生理生化及基因工程研究。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.02.010

S816.4

A

1003-6202(2017)02-0044-04