双酶法水解汉麻粕蛋白工艺的研究

魏连会，宋淑敏，董 艳，刘宇峰

(黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江 大庆 163319)

双酶法水解汉麻粕蛋白工艺的研究

魏连会，宋淑敏，董 艳，刘宇峰

(黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江 大庆 163319)

采用木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶复合水解汉麻粕蛋白，以水解度为指标，研究双酶水解汉麻粕蛋白的最佳工艺条件。首先加入碱性蛋白酶，在温度55℃、pH11、加酶量为3%、料液比为1∶5、时间为2 h的条件下，进行第一次酶解，达到酶解时间，高温灭酶，冷却后调节pH值为5；然后加入木瓜蛋白酶，在温度70℃，加酶量0.4%，进行第二次酶解，1 h后，高温灭酶,冷却，离心,上清液为汉麻粕蛋白酶解液，水解度为26.42%。

木瓜蛋白酶；碱性蛋白酶；汉麻粕蛋白;水解；多肽

汉麻粕含有较高的蛋白质(质量分数达40%以上)，其中，麻仁蛋白占65%，白蛋白占35%。麻仁蛋白具有促消化作用，白蛋白含有人体所需要的各种氨基酸[1-2]。对汉麻粕蛋白进行氨基酸组成分析，发现其含有丰富的必需氨基酸。不仅含有丰富的精氨酸和谷氨酸，同时含有天冬氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、亮氨酸、缬氨酸和异亮氨酸。特别是精氨酸和组氨酸对儿童的生长发育有着重要的作用[3]。

目前，汉麻粕作为汉麻籽油脂加工的下脚料，主要利用途径是作为动物的饲料使用，综合利用价值较低。通过酶法水解汉麻粕蛋白，得到具有生物活性的多肽，不仅能够丰富植物蛋白多肽的种类，更为汉麻粕综合利用开发出一种新型模式。研究表明，人体对蛋白质的消化吸收，并非主要以氨基酸的形式，而是以生物多肽的形式吸收[4]。生物多肽不仅能够提供人体生长所需要的营养物质，而且具有抗氧化、降血压、降血糖等多种生理功能[5-7]。因此，将汉麻粕酶解制备多肽，不仅可以提高汉麻粕的利用价值，增加其产品的附加值，产生巨大的经济效益，而且对开发功能保健食品、促进人类健康具有积极的拖动作用。

碱性蛋白酶是一种丝氨酸肽链内切酶，可水解肽链为芳香族氨基酸，可使芳香族氨基酸暴露，为得到芳香族氨基酸奠定基础；木瓜蛋白酶兼具内切肽酶和外切肽酶的活性，在一定的条件下可断裂芳香族氨基酸，使芳香族氨基酸释放出来。两者复合使用可制备功能活性更强的高F值寡肽。

本研究采用碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶复合酶法制备汉麻籽多肽，确定最佳的酶解工艺条件，为汉麻多肽在功能食品和医药领域利用，提高汉麻粕精深加工产品的附加值，促进汉麻产业发展奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

木瓜蛋白酶，碱性蛋白酶，汉麻粕蛋白。

1.2 试验方法

1.2.1 汉麻粕基本成分的测定

汉麻粕粗蛋白的测定采用GB 5009.5—2010,汉麻粕粗脂肪的测定采用GB/T 5009.6—2003,汉麻粕中灰分的测定采用GB 5009.4—2010,汉麻粕中水分的测定采用GB 5009.3—2010。

1.2.2 测定指标

汉麻粕的水解度测定采用福林酚比色法[8]，蛋白质水解度用DH表示。

DH=(N2-N1)/(N0-N1) ×100%，

式中，N0为不同浓度汉麻蛋白溶液氮含量，mg/ml；N1为蛋白酶水解前可溶性氮含量，mg/ml；N2为蛋白酶水解后可溶性氮含量，mg/ml。

1.2.3 工艺路线

汉麻籽粕→调整料液比→调整pH值和温度→加蛋白酶→酶解→灭酶→过滤→离心→提取上清液→真空干燥→多肽粉。

1.2.4 碱性蛋白酶酶解单因素试验

温度对酶解效果的影响：称取脱脂汉麻粕5 g, 溶于50 ml蒸馏水中，调节pH值为10，加入2%的碱性蛋白酶，置于水浴锅中，分别调节40、45、50、55、60℃这5个不同的温度，进行酶解2 h,酶解后测定水解度。

pH值对酶解效果的影响：称取脱脂汉麻粕5 g, 溶于50 ml蒸馏水中，分别调节pH值为8、9、10、11、12，加入2%的碱性蛋白酶，置于水浴锅中调节温度为60℃进行酶解，酶解2 h，测定不同条件下的水解度。

加酶量对酶解效果的影响：称取脱脂汉麻粕5 g, 溶于50 ml蒸馏水中，调节pH值为10，分别加入1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的碱性蛋白酶，置于水浴锅中调节温度为60℃进行酶解，酶解2 h，测定不同条件下的水解度。

酶解时间对酶解效果的影响：称取脱脂汉麻粕5 g, 溶于50 ml蒸馏水中，调节pH值为10，加入2%的碱性蛋白酶，置于水浴锅中调节温度为60℃进行酶解，分别酶解1、2、3、4、5 h，测定不同条件下的水解度。

料液比对酶解效果的影响：称取脱脂汉麻粕, 分别按照1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30料液比溶于蒸馏水中，调节pH值为10，加入2%的碱性蛋白酶，置于水浴锅中调节温度为60℃进行酶解，酶解2 h,测定不同条件下的水解度。

1.2.5 碱性蛋白酶酶解正交试验

根据单因素试验结果，确定酶解时间为2 h, 对影响酶解效果的其他因素进一步设计正交试验，确定碱性蛋白酶的最佳酶解条件。碱性蛋白酶正交试验因素水平见表1。

1.2.6 木瓜蛋白酶酶解单因素试验

温度对酶解效果的影响：称取脱脂汉麻粕5 g, 溶于50 ml蒸馏水中，调节pH7，加入0.2%的木瓜蛋白酶，置于水浴锅中调节55、60、65、70、75℃这5个不同的温度进行酶解2 h，酶解后测定水解度。

pH值对酶解效果的影响：称取脱脂汉麻粕5 g, 溶于50 ml蒸馏水中，分别调节pH值为3、5、7、9、11，加入0.2%的木瓜蛋白酶，置于水浴锅中调节温度为60℃进行酶解2 h，测定不同条件下的水解度。

加酶量对酶解效果的影响：称取脱脂汉麻粕5 g, 溶于50 ml蒸馏水中，调节pH7，加入0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的木瓜蛋白酶，置于水浴锅中调节温度为60℃进行酶解2 h，测定不同条件下的水解度。

酶解时间对酶解效果的影响：称取脱脂汉麻粕5 g, 溶于50 ml蒸馏水中，调节pH7，加入0.2%的木瓜蛋白酶，置于水浴锅中调节温度为60℃进行酶解，分别酶解1、2、3、4、5 h,测定不同条件下的水解度。

料液比对酶解效果的影响：称取脱脂汉麻粕5 g，按照1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25料液比溶于蒸馏水中，调节pH7，加入0.2%的木瓜蛋白酶，置于水浴锅中调节温度为60℃进行酶解2 h，测定不同条件下的水解度。

1.2.7 木瓜蛋白酶酶解正交试验

根据单因素试验结果，确定酶解时间1 h，对影响酶解效果的其他因素进一步设计正交试验，确定木瓜蛋白酶的最佳酶解工艺条件。木瓜蛋白酶的正交试验因素水平见表2。

1.2.8 双酶酶解试验

为了进一步提高酶解效果，采用两种酶复合水解，先用一种酶水解，达到酶解时间，灭酶后，再用第二种酶酶解。

表2 木瓜蛋白酶酶解正交设计表

1.2.9 数据处理

单因素采用Excel 处理，正交试验采用DPS数据处理软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 汉麻粕基本成分

汉麻品种的不同以及汉麻籽油提取工艺的不同，都会影响汉麻粕的基本成分。对试验所用的汉麻粕采用国标法进行检测，基本成分见表3。

表3 汉麻粕基本成分

2.2 单因素及正交试验结果

2.2.1 碱性蛋白酶酶解单因素试验

2.2.1.1 温度对碱性蛋白酶酶解效果的影响

温度对碱性蛋白酶酶解效果的影响见图1。在试验所选的温度范围内，随着温度的升高，水解度呈现逐渐增大的趋势，当温度达到55℃时，水解度不再显著变化，表明已达到酶解的最适宜温度。因此，选择55℃作为最佳的酶解温度。

图1 温度对汉麻粕蛋白水解度的影响

2.2.1.2 pH值对碱性蛋白酶酶解效果的影响

pH值对碱性蛋白酶酶解效果的影响见图2。

图2 pH值对蛋白水解度的影响

当反应的pH值在8～10内，随着pH值的升高，水解度增大，当pH值大于10时，水解度呈现下降的趋势。这是由于pH值的变化能够引起酶活性中心的分子构象的改变，从而影响酶与底物的结合，影响酶的活性[9]。因此,选择最佳的酶解pH值为10。

2.2.1.3 酶解时间对碱性蛋白酶酶解效果的影响

酶解时间对碱性蛋白酶酶解效果的影响见图3。随着酶解时间的延长，水解度先增大，后来趋于平缓，试验选取2 h为最佳酶解时间。

图3 酶解时间对汉麻粕蛋白水解度的影响

2.2.1.4 加酶量对碱性蛋白酶酶解效果的影响

加酶量对碱性蛋白酶酶解效果的影响见图4。随着碱性蛋白酶的添加量增大，水解度随之增大，当添加量达到2.5%时，再增大加酶量，水解度趋于平缓，考虑生产成本，确定2.5%作为碱性蛋白酶酶解的添加量。

图4 加酶量对汉麻粕蛋白水解度的影响

2.2.1.5 料液比对碱性蛋白酶酶解效果的影响 料液比对碱性蛋白酶酶解效果的影响见图5。料液比影响底物的浓度，底物浓度过高，酶与底物无法在水中充分分散，酶与底物结合的难度大，影响酶解效果。底物浓度过低，酶分子不能完全与底物蛋白结合，影响酶效，试验选取1∶15作为最佳的料液比。

图5 料液比对蛋白酶水解度的影响

2.2.2 碱性蛋白酶酶解正交试验结果

由表4可知，影响碱性蛋白酶酶解的各个因素主次关系依次为：温度、料液比、pH值、加酶量，得出碱性蛋白酶酶解的最佳工艺条件为A2D1B3C3，即酶解温度为55℃，pH11，料液比为1∶10，加酶量为3%，在此最佳的理论值基础上进行了验证试验，得到DH为12.97%。

表4 碱性蛋白酶正交试验结果分析

2.2.3 木瓜蛋白酶酶解单因素试验

2.2.3.1 温度对木瓜蛋白酶酶解效果的影响

温度对木瓜蛋白酶酶解效果的影响见图6。随着温度升高，水解度在55～60℃变化不明显，60～75℃时，先增大后降低。酶作为生物催化剂有最适宜的温度，所以当温度升高时，酶解作用加强，但温度过高会失活变性，所以在一定温度内，酶的催化活力呈现先增大后降低的趋势。试验选取70℃作为最佳的酶解温度。

图6 温度对汉麻粕蛋白水解度的影响

2.2.3.2 pH值对木瓜蛋白酶酶解效果的影响

pH值对木瓜蛋白酶酶解效果的影响见图7。

图7 pH值对汉麻粕蛋白水解度的影响

pH值能够影响酶活性中心的构象，从而影响酶的活性。试验所选pH值范围内，木瓜蛋白酶酶解，水解度先增大后降低。由图7可知，pH5为木瓜蛋白酶的最佳酶解pH值。

2.2.3.3 酶解时间对木瓜蛋白酶酶解效果的影响

酶解时间对木瓜蛋白酶酶解效果影响见图8。由图8可知，随着酶解时间的延长，蛋白质的水解度几乎没有变化，可见当酶解1 h，汉麻粕蛋白已经被水解完全。因此,选择1 h作为最佳的酶解时间。

图8 时间对汉麻粕蛋白水解度的影响

2.2.3.4 加酶量对木瓜蛋白酶酶解效果的影响

酶的添加量对木瓜蛋白酶酶解效果的影响见图9。随着木瓜蛋白酶的添加量增大，水解度随之增大，当添加量达到0.4%时，再增大加酶量，水解度趋于平缓，考虑生产成本，确定0.4%作为酶最适的添加量。

图9 加酶量对汉麻粕蛋白水解度的影响

2.2.3.5 料液比对木瓜蛋白酶酶解效果的影响

料液比对木瓜蛋白酶酶解效果的影响见图10。在试验所选料液比范围内，随着料液比的增大，汉麻粕蛋白水解度先增大后降低，在1∶10时水解度最高。因此，选取1∶10作为最佳的稀释料液比。

图10 料液比对汉麻粕水解度的影响

2.2.4 木瓜蛋白酶酶解正交试验结果

由表5可知，影响木瓜蛋白酶酶解的各个因素主次关系依次为：pH值、料液比、加酶量、温度，得出木瓜蛋白酶酶解的最佳工艺条件为B2D1C2A2，即酶解温度为70℃，pH5，料液比为1∶5，加酶量为0.4%，在此最佳的理论值基础上进行了验证试验，得到DH为21.03%。

2.3 双酶酶解试验

由于单一的酶种水解能力有限，尝试采用两种酶复合水解，以期进一步提高汉麻粕蛋白的水解度。首先采用一种酶进行酶解，酶解完全后，进行灭酶处理，再按照第二种酶的酶解条件继续酶解。考虑到生产操作方便，将料液比按照1∶5、1∶10、先按照1∶5再调整到1∶10三种条件进行试验，其他条件则按照碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶各自酶解最优条件进行。

由表6可知，先采用碱性蛋白酶酶解再用木瓜蛋白酶解，其水解效果优于先木瓜蛋白酶后碱性蛋白酶酶解，分析原因可能是在碱性的条件下，能够使更多的蛋白质从汉麻粕中溶出，增加其与酶的接触机会，故水解效果好，水解度高。通过调整不同的料液比，发现采用木瓜蛋白酶在料液比1∶5的条件下，水解效果最佳。

表5 木瓜蛋白酶酶解正交试验结果分析

表6 两种酶不同酶解顺序对汉麻水解度的影响

3 结论

本试验对碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶对汉麻粕的酶解条件进行研究，采用正交试验优化了单一酶酶解的条件，并在此基础上尝试用两种酶复合水解汉麻粕，确定了复合酶解的工艺条件：调整料液比1∶5，先采用碱性蛋白酶酶解：温度55℃、时间2 h、pH11、加酶量3%，达到酶解时间后再高温灭酶；之后加入木瓜蛋白酶进行酶解，温度70℃，时间1 h，料液比1∶5，pH5，加酶量0.4%。通过两种酶复合水解，水解度达到26.42%，极大的提高了水解的效果。

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(责任编辑：赵琳琳)

Hydrolysis technology ofCannabissativalprotein by bi-enzyme hydrolysis

WEI Lian-hui, SONG Shu-min, DONG Yan,LIU Yu-feng

(Daqing Branch of Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing 163319,China)

Papain and alkalesceny protease were chosen to hydrolyze the protein ofCannabissatival.By analyzing the degree of hydrolysis ofCannabissativalprotein,the optimum conditions of the enzymolysis were studied.First,it was found the optimum enzymolysis conditions of alkalescency were as liguid-solid ratio of 1∶5,amount of protease 3%,pH11,temperature 55℃ and hydrolysis time of 2 h.After that, papain protease was used to hydrolyze theCannabissativalprotein again.And the optimum conditions were as amount of protase 0.4%,pH5, temperature 70℃ and hydrolyzing time of 1 h. The final degree of hydrolysis was 26.42%.

papain protease;alkalesceny protease;cannabis satival protein； hydrolysis;peptide

2016-09-08；

2017-01-11

黑龙江省财政厅、黑龙江省科学院资助项目(20160101)。

魏连会(1983-)，男，硕士，研究实习员，从事功能性食品研究。

宋淑敏(1968-)，女，研究员级高级农艺师，主要从事植物生物技术研究。

10.7633/j.issn.1003-6202.2017.02.005

TS229;TS201.2+5

A

1003-6202(2017)02-0020-05