一个新突触蛋白PRRT2的研究进展

马红樱

(湖北理工学院 医学院,湖北 黄石 435003)

一个新突触蛋白PRRT2的研究进展

马红樱

(湖北理工学院 医学院,湖北 黄石 435003)

近几年的研究表明，PRRT2基因是PKD、BFIS、ICCA、偏头痛、发作性共济失调、热性惊厥、癫痫等多种发作性疾病的致病基因。进一步功能研究发现，PRRT2蛋白主要富集于大脑神经元的突触前膜，与SNARE复合物蛋白相互作用，参与调节突触功能并促进突触囊泡的胞吐过程，因此提出PRRT2是一个新的突触蛋白。更重要的是，突变型PRRT2蛋白的表达水平低于野生型，并且膜定位发生改变，从而使该蛋白的功能缺失。由此推测，由于患者中PRRT2蛋白单倍剂量不足而导致神经递质释放失调，可能是PRRT2相关疾病的致病机制。文章主要就近年来对PRRT2的研究进展进行了综述。

PRRT2；突触蛋白；功能缺失；PRRT2相关疾病

0 引言

自2011年Chen等报道了PRRT2是PKD的致病基因以来[1]，对PRRT2的研究越来越引人注目，更多的研究报道了PRRT2突变与BFIS、ICCA、偏头痛、发作性共济失调、热性惊厥、癫痫等多种突发性神经性疾病相关联，迄今为止已经鉴定到PRRT2的70多个突变引起不同表型的神经系统疾病[2]。多数研究集中在PRRT2突变的表型谱的鉴定，而其具体的生理功能的研究甚少。最近的研究揭示了PRRT2蛋白是富含脯氨酸的具有特殊拓扑结构的II型跨膜蛋白，其很长的N端位于胞内侧，只包含2个氨基酸残基的C端位于胞外。PRRT2蛋白主要富集于皮质、海马、基底节和小脑等大脑区域神经元的突触前膜，与SNARE复合物核心蛋白相互作用，参与调节突触神经递质的释放并促进囊泡的胞吐过程，在突触发育和突触功能中发挥重要功能，因此提出PRRT2是一个新的突触蛋白[3]。本文就其在遗传学和分子生物学领域取得的最新进展进行综述。

1 PRRT2的结构研究

PRRT2基因位于染色体16p11.2，包含4个外显子。PRRT2蛋白是由3个外显子(2～4extrons)编码的富脯氨酸(proline-rich region,PRD)的II型跨膜蛋白，全长由340个氨基酸组成。一直以来，研究者们推测PRRT2蛋白也有类似于Dispanins家族其他成员的拓扑结构：即有2次跨膜结构域和一个胞质环，长的N末端和短的C末端位于质膜外侧。直到最近，Rossi(2016)用活体免疫标记、免疫胶体金电子显微镜、细胞表面生物素酰化以及计算机建模的方法证实了PRRT2蛋白的新的拓扑结构：包含PRD结构域的N端(1-268aa)定位于细胞质，而只有2个氨基酸的短的C端在胞外，中间被一个长约28个氨基酸(290～317aa)的胞质环隔开。尽管和Dispanins家族的其他成员相似，但PRRT2蛋白不同的是，只有第2个疏水片段(M2)才真正跨越质膜，而第1个疏水片段(M1)由于其中间大约279位脯氨酸的出现使α-螺旋产生一个回折，破坏了α-螺旋结构，因而形成一个螺旋-环-螺旋(Helix-loop-helix)结构，该结构域主要与质膜的内表面结合，其结果是M1没有跨越质膜[4]。

PRRT2基因编码蛋白高度保守，通过DNAMAN V6多序列比对发现，C端结构域序列相似性在哺乳动物中增加到超过90%，尤其是2个疏水性结构域(M1和M2)极度保守。小鼠PRRT2同源蛋白与人的PRRT2蛋白在C端序列一致，只在N端有很少差别[4]。因此推测，位于质膜内侧的疏水性Helix-loop-helix结构域和胞质的PRD结构域可能在该蛋白的生理功能中起关键作用。

2 PRRT2是一个新的突触蛋白

研究证实PRRT2与突触前SNARE(Soluble NSF Attachment Protein REceptor)复合物蛋白SNAP25(Synaptosomal-associated Protein,25kDa)相互作用[5]，并且共定位于突触前膜和突触后膜[6]。随后越来越多的证据支持这一结果，PRRT2定位在突触前膜，尤其富集于突触联系处[3,6-8]，然而，对PRRT2在突触前膜的确切生理功能还不清楚。Valente et al.(2016)最近研究证实PRRT2是一种突触前膜蛋白，富集在突触前末梢，在胚胎期突触发生时开始表达，出生后突触形成和重排时期的表达量达到高峰。除了与SNAP25相互作用外，与快速同步释放的Ca2+感受器synaptotagmin (Syt)1/2(一种突触结合蛋白)相互作用，并赋予SNARE复合物的Ca2+敏感性，从而促进突触囊泡的胞吐过程。并且，在体外培养的原代神经元中，敲低PRRT2的表达水平导致突触的数量减少，突触的超微结构发生改变，并且严重损伤突触联系的形成[3,6]。电生理实验也证实，敲低PRRT2蛋白后影响了突触前膜Ca2+介导的兴奋-分泌耦合过程，神经递质的释放减少，并且静息状态的停靠囊泡数量明显增加，说明PRRT2是突触前膜释放装置的重要组分，对同步的神经递质释放是必需的，在突触囊泡融合过程中充当催化剂的作用[3]。与此结果相一致，敲低小鼠体内PRRT2蛋白水平导致出生后小鼠神经元突触密度明显减小[6]。总之，以上这些结果进一步支持了PRRT2是一种新的突触蛋白，参与突触发生，并且在突触传递过程中起关键的调节作用。

相比较于突触前膜，尽管含量很低，也有小部分的PRRT2蛋白定位在突触后膜致密区[3,6]。最近通过高分辨率蛋白质组研究发现， PRRT2在突触后膜参与组成AMPA型谷氨酸受体的一部分[9-10]，并限制GRIA1在膜上的分布，从而调节谷氨酸的释放[11]。

3 PRRT2突变与多种突发性神经性疾病相关联

大量研究报道了PRRT2是发作性运动诱发性运动障碍(Paroxysmal Kinesigenit Dyskinesia，PKD)，良性家族性婴儿惊厥(Benign Familial Infantile Seizures,BFIS)和婴儿惊厥伴阵发性舞蹈手足徐动症(Infantile Convulsions and Paroxysmal Choreoathetosi,ICCA;也称为婴儿惊厥伴随发作性运动诱发性运动障碍(infantile convulsions with PKD,PKD/IC))的致病基因[1,12-13]。随后的研究证实，在偏头痛、偏瘫型偏头痛、发作性共济失调、发作性非运动源性运动障碍(PNKD)及发作性过度运动诱发性运动障碍(PED)家系及散发患者中也存在PRRT2突变，这一系列发作性疾病可能是PRRT2相关疾病的不同表型[12,14]，表明PRRT2突变的临床异质性的特点。除此之外，近几年更多的研究小组鉴定了PRRT2突变后也引起不同的癫痫表型，如热性惊厥(febrile seizures,FS)、儿童失神癫痫(childhood absence epilepsy,CAE)、婴儿无惊厥发作(infantile non-convulsive seizures,INCS)、夜间惊厥(nocturnal convulsions,NC)等[13,15-16]。更为复杂的是， Labate et al.(2013)发现携带相同PRRT2突变c.649dupC的2个家系中FS和BFIS 2个表型共存。Liu et al.(2013)也研究报道了无义突变c.649C>T导致PKD和全身性癫痫(generalized tonic-clonic seizures,GTCS)2种表型。而且一个携带c.718C>T无义突变的散发BIE患者，表现出失神发作[17]。Van Vliet et al.(2012)也报道了相同的突变c.649C>T导致婴儿惊厥(infantile convulsions,IC)、ICCA和PKD等多种表型[13]。最近， Maini et al.(2016)报道了一个PRRT2突变c.649dupC的新表型，癫痫伴随婴儿早期的良性的肌阵挛(epilepsy and benign myoclonus of earlyinfancy)，进一步拓宽了PRRT2的表型谱[18]。总结大量的病例报道，一般在婴儿期，PRRT2突变引起癫痫，而在儿童期或青少年期，PRRT2突变引起PKD。发病年龄影响表型类型和严重程度，可能与PRRT2的年龄依赖的表达模式有关。

4 与疾病相关的PRRT2突变的遗传特征

4.1大多数PRRT2突变是截短突变

目前为止，已经报道的PRRT2突变超过70个[2]，包括5个微缺失。其中移码突变34个，主要集中在第2个外显子中，造成不同长度的N端截短蛋白。无义突变7个，错义突变20个，6个剪接突变。错义突变主要位于C端的2个疏水性结构域和胞质环。超过80%的PRRT2突变患者有c.649dupC突变，而且该突变也导致FS、BFIS和无热性部分发作(afebrile focal seizures)等癫痫表型，因此，它是PRRT2的突变热点[19]。截短突变和无义突变占61.2%[8,13]，主要集中在N端，使截短的突变型PRRT2蛋白缺失C端的保守结构域。已经证实，由无义突变或移码突变引起的PRRT2截短蛋白的蛋白质表达水平明显低于野生型，主要原因是这些突变引发的NMD(nonsense-mediated mRNA decay)机制对其mRNA进行降解，其结果导致这些截短蛋白的功能缺失[20]，最终由于PRRT2蛋白单倍剂量不足(haploinsufficiency)而引发疾病[6]。

4.2临床异质性和不完全显性

PRRT2基因突变引起的临床表型谱很广泛，涉及到从运动障碍到癫痫的多种发作性表型。甚至相同的突变(c.649dupC)导致的表型也不相同，如PKD、ICCA、BFIE、FS、无热性部分发作等。这些结果说明PRRT2基因与GluT1[21]和ATP1A2基因[22]一样，有多效性特征[23]。PRRT2蛋白在神经系统广泛表达，在苍白球、小脑、丘脑底核、小脑脚、尾状核及大脑皮层均有高表达，尤其在大脑皮质、海马、小脑中表达较高[1]。研究证实PRRT2 的mRNA水平随着小鼠大脑发育而变化，在胚胎期16 d时mRNA开始表达而后逐渐上升，到出生后第7 d时在大脑和脊髓大量表达，而到出生后第14 d(对应于人的1～2岁)时PRRT2的mRNA水平达到最高峰，随后出现下降并在成年鼠mRNA下降到相对低的水平[1]。而且PRRT2表达量随年龄而变化的现象符合一些PRRT2相关疾病，如BFIS在婴儿早期发病，随后症状缓解的这种年龄依赖性的特征[2]。因此，PRRT2在大脑的高表达以及随年龄依赖的表达模式，可以部分解释PRRT2突变表型异质性的原因，如同BFNIS(benign familial neonatal-infantile seizures)[8,24]中SCN2A钠通道的突变一样[24](SCN2A在发育过程中瞬时表达，BFNIS的症状在成年逐渐缓解)，可以解释随着年龄增长自发性癫痫发作缓解的原因。

PRRT2突变的另一个特征是低外显率，或者称为外显不全。Van Vliet et al.(2012)报道的PKD家系中PRRT2突变的外显率是61%[13]。可能原因是富含脯氨酸蛋白的弱的非特异性结合特征，PRRT2突变对正常蛋白功能的影响相对有限。另外，和无症状的突变携带者相比，患者从无携带突变的父母遗传了相对表达弱的野生型等位基因，造成野生型等位基因的蛋白水平较低，这些因素都可以解释PRRT2突变造成不完全显性的原因。然而，PRRT2突变引起临床表型异质性和不完全显性的确切原因还不清楚。因此，还需深入探究发育过程中的其他因素对PRRT2基因表型变异性和不完全显性的影响[7,25]，如DNA甲基化模式和野生型等位基因对突变型等位基因的表达修饰作用等。

4.3 PRRT2突变的遗传方式

PRRT2突变的遗传方式主要是常染色体显性遗传并伴外显不全，也有常染色体隐性遗传的方式。Labate et al.(2012)等研究发现PRRT2纯合突变的表型比较严重，包括精神发育迟滞、共济失调、智力障碍、癫痫[17]。另外， Liu et al.(2013)研究报道了一个散发患者携带PRRT2复合杂合突变,2个突变c.647C>G和c.510dupT分别来自无症状的父亲和母亲，属常染色体隐性遗传，该患者临床表型为INCS，后来发展成PNKD[15]。说明双倍剂量的PRRT2突变对大脑的病理过程产生叠加效应，从而导致更严重的表型。

5 PRRT2相关疾病的致病机理

PRRT2突变与运动障碍、癫痫和偏头痛等多种突发性疾病相关联，说明这些疾病的分子发病机制可能存在重叠。而且已经证实，PRRT2蛋白主要在大脑皮质、海马、基底节和小脑高表达，并富集于神经元的突触前膜。更重要的是，这些区域与推定的PRRT2相关疾病的神经元起源部位相一致。然而，PRRT2的致病机制还不清楚。Valente et al.(2016)最近研究证实PRRT2是一种突触前膜蛋白，是Ca2+依赖的神经递质同步释放装置的关键组分，与突触小体相关蛋白25(SNAP25)、Ca2+感受器synaptotagmin1/2(Sty1/2)以及囊泡相关膜蛋白2(VAMP2)相互作用，并赋予SNARE复合物的Ca2+敏感性[3,6]。这些结果表明PRRT2在突触前膜可能参与调节神经递质释放，其功能失常导致神经递质释放失调进而引发动态的神经元网络不稳定。可喜的是，抗癫痫药能调控电压依赖的Ca2+通道并很大程度上使其功能恢复正常[26]，此结果可以解释卡马西平对PRRT2相关疾病，尤其是PKD有效的原因[27]。与此相一致的是，研究已证实，在发作类疾病和癫痫的发病机制中突触传递的失调，尤其是兴奋性突触和抑制性突触间的失衡起重要作用[28]。Valente et al.(2016)通过敲低体外培养的神经元中PRRT2表达的研究发现，PRRT2蛋白功能缺失导致神经元兴奋性突触的易化作用加强，或者抑制性突触的抑制作用减弱[3]，最终导致神经递质释放失衡，促使发作性疾病的发生。这些机制与在PRRT2敲低的小鼠模型中观察到的突触超微结构异常、突触功能改变以及神经元迁移延迟的结果是相一致的[3,6]。早已证明神经元迁移延迟和异常的棘密度与各种认知、学习和记忆缺陷相关联[29-30]，进一步支持了PRRT2参与突触调节的功能。

因此，在PRRT2相关疾病中，PRRT2在大脑不同区域的兴奋性神经元和抑制性神经元的异质性分布，以及突变引起的PRRT2的单倍剂量不足可能导致区域特异性的神经元兴奋性和抑制性之间的失衡，最终引起突触失调(synaptic deregulation)和神经元超兴奋性，触发运动障碍、癫痫和偏头痛等发作性疾病的发生。

6 讨论

PRRT2蛋白与SNARE复合物蛋白相互作用，参与调节突触功能。多种突变型PRRT2蛋白由于单倍剂量不足而导致神经递质释放失调，进而引发发作性疾病的发生。然而，目前对PRRT2蛋白功能和致病机制的研究还不能解释PRRT2突变的表型异质性和显性不全的原因，以及突变型PRRT2引发疾病的信号通路仍不明确。另外， Portmann et al.(2014)证实PRRT2在Drd2+的神经元中富集，而且16p11+/-小鼠大脑中多巴胺信号发生改变，多巴胺回路异常[31]。和小鼠模型相类似的结果，一例包含PRRT2基因在内的一段染色体缺失患者不仅患有PKC，而且还患有多巴胺依赖的帕金森(Dopa-responsive parkinsonism)[32]，因此推测PRRT2可能参与多巴胺的神经传递[31]。有趣的是，对PNKD模型小鼠研究显示多巴胺释放增加以及多巴胺受体表达升高，表明多巴胺信号诱导运动障碍，并且PNKD基因突变会干扰多巴胺能信号传导过程[33]。因此，PRRT2是否和PNKD蛋白类似，通过调节多巴胺的释放而调节神经元的递质释放平衡还需进一步研究。除此之外，Labate et al.(2013)发现在一个BFIS家系中，携带c.649dupC纯合突变的患者有无热性部分癫痫(afebrile focal seizures)，14岁死于SUDEP(sudden unexpected death in epilepsy)，而且PRRT2也在心脏表达，我们推测PRRT2突变可能与SUDEP之间存在联系[17]。另有证据表明，富含脯氨酸的蛋白质基因在应答应激损伤时诱导产生，有利于保护心肌细胞的受损。但是，PRRT2与心肌细胞的结构及功能之间的关联还不得而知，将来还需要深入探究PRRT2突变与SUDEP的发病机制。

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(责任编辑吴鸿霞)

Research Progress of a Novel Synaptic Protein PRRT2

MaHongying

(School of Medicine,Hubei Polytechnic University,Huangshi Hubei 435003)

Recent studies have shown that PRRT2 is the causative gene of PKD,BFIS,ICCA,migraine,episodic ataxia,febrile seizures and epilepsy.Further functional studies have found that PRRT2 protein is mainly enriched in presynaptic membrane of neurons,where it interacts with SNARE proteins,and is involved in mediating synaptic function and promoting the exocytosis of synaptic vesicles.More importantly,most of the expression level of mutant PRRT2 protein is lower than that of wild type,and the subcellular localization of mutant PRRT2 is abnormal,and losting membrane targeting,all of these caused the loss of function of PRRT2.It is speculated that due to the haploinsufficiency of PRRT2 protein in patients leads to neurotransmitter release disorders,which may be the pathogenesis of PRRT2-related diseases.This paper reviews the progress of research on PRRT2 in recent years.

PRRT2;synaptic protein;loss of function;PRRT2-related diseases

2017-04-25

马红樱，讲师，博士生，研究方向：医学遗传学。

10.3969/j.issn.2095-4565.2017.04.011

Q71

：A

：2095-4565(2017)04-0056-06