拟南芥生物钟突变体lhy、cca1营养生长时相转变

郭蕊，傅钰，龙鸿

高等植物生长发育是一个持续的过程，其胚后发育主要经历了营养生长阶段和生殖生长阶段。营养生长是促成高等植物早期形态的必经阶段，由幼龄期和成熟期构成[1]。从幼龄期过渡到成熟期就发生了营养生长时相转变（vegetative phase change,VPC），经历这个转变后，植物才具有开花能力，从而进入生殖生长时期，完成整个生活史[2]。

高等植物VPC过程会伴随着营养生长状态的变化。模式植物拟南芥的研究表明，幼龄期的叶片边缘光滑，叶片近圆形，叶基角较小，只有近轴面表皮毛；而成熟期的叶片边缘出现锯齿，叶片近匙形，叶片基角增大，近轴面和远轴面均具有表皮毛[2]。对VPC的相关分子研究表明，MicroRNA（miRNA） precursormiR156在VPC中发挥重要作用，幼龄期表达量高，成熟期表达量低[3-5]。

植物通过内在的“钟”来应答夜长及其调控，以保证其在24 h的节律中生长发育，即所谓的生物钟[6]。LATE ELONGATED HYPOCOTYL（LHY）、CIRCADIAN CLOCK ASSOCIATED1（CCA1）和TIMING OF CABEXPRESSION1（TOC1）3个基因构成了生物钟的一个反馈环，其中LHY结合CCA1负调控TOC1表达，TOC1则正向调控LHY和CCA1表达[7]。VPC与植物自身的生物节律联系紧密，但是生物钟相关基因对VPC的影响还不清楚。本研究通过观察研究拟南芥lhy、cca1突变体的VPC过程，探讨LHY、CCA1基因对VPC的影响，为生物节律与VPC之间的关联提供试验依据。解析VPC的分子机制，对于果树生产上尽早结束幼龄期（童期）而进入成熟期，开花结果，使得果农及早受益，具有重要的理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

拟南芥Col-0生态型的种子由作物遗传改良国家重点实验室须健教授课题组惠赠，WT-Col背景下的lhy（CS811112）、cca1（SALK_067780）突变体的种子购自美国俄亥俄州立大学的Arabidopsis Biological Resource Center（ABRC）。

1.2 方法

1.2.1 种植

种子在4℃条件下处理2～3 d，打破休眠并春化，然后点种至塑料盆中，并贴好标签，盖上保鲜膜，7d后揭膜。培养条件为V营养土∶V蛭石＝1∶1，并高温灭菌，用蒸馏水充分浸泡，每3 d浇水一次。培养条件为：22℃，光照培养16 h，暗培养8 h，相对湿度 60%，光照强度 180 μmol/（m2·s）。

1.2.2 形态观察

待种子长出子叶后，开始观察野生型Col-0及突变体lhy、cca1的表型。抽薹前，每天统计其莲座叶总数，最早出现远轴面表皮毛时的叶序数及莲座叶数，并观察其叶片形态变化；抽薹后，将所有莲座叶片摘下，拍照并使用DWRuler测量其叶片近轴面右侧与叶柄之间形成的叶片基角。

1.2.3 制作石蜡切片

待拟南芥长出真叶时，开始取材，按照李和平等[8]的方法进行操作，材料置于FAA固定液中固定至少24 h；梯度乙醇脱水，石蜡包埋，爱氏苏木精染色，LEICA2235轮转切片机切片，厚度为8µm，LEICA DM4000B显微镜观察，LEICA DFC450相机拍照保存。

1.2.4 荧光定量PCR

利用荧光定量PCR做基因miR156表达分析，内参基因为Actin-2。使用实时荧光定量PCR仪（BIO-RAD CFX96）和北京全式金荧光定量试剂盒（TransStartTM Top Green qPCR SuperMix）进行实验。miR156扩增采用颈环法，引物序列：Actin2-F：5′-GCTGAGAGATTCAGA TGCCCA-3′，Actin2-R：5′-GTGGATTCCAGCAGCTTCCAT ACT-3′；miR156-F:5′-CATCTTGTA GATCTC TGAAGTTGG ACT-3′，miR156-R:5′-GAGATT GAGACATAGA GAACGAAGACA-3′。

2 结果与分析

2.1 突变体的叶形与最早远轴面表皮毛出现的叶序数

通过对野生型Col-0和lhy、cca1突变体的叶形变化的观察比较了解其VPC特征。结果显示，野生型Col-0莲座叶叶片总数近为10片，前4片叶近圆形，后期叶片则呈渐长的匙形，远轴面表皮毛为第6片（第15天时）（图1-A）；突变体lhy的莲座叶总数近为12片，前4片莲座叶接近圆形，后期的叶片呈渐长的匙形，远轴面表皮毛最早出现在第7片莲座叶上（第16天时）（图1-B）；突变体cca1的莲座叶叶片总数近为13片，前4片莲座叶接近圆形，后期的叶片呈渐长的匙形，出现远轴面表皮毛也为第7片（第16天时）（图1-C），表明野生型Col-0和突变体lhy、cca1分别在第6、第7、7片叶时发生VPC，且突变体出现的远轴面表皮毛的时间都晚于野生型，说明lhy、cca1突变体的VPC被延迟。

图1 野生型Col-0与lhy、cca1突变体的生长发育情况及叶形图

2.2 突变体的叶片基角

在植物营养生长时期，叶片基角随着VPC的发生而产生变化。通过测量野生型Col-0和lhy、cca1突变体莲座叶的叶片基角，分别选取莲座叶的第3、6、9片的叶片基角来比较野生型和突变体的差异。结果表明，野生型Col-0和lhy、cca1突变体莲座叶的叶片基角都呈增大趋势，但是lhy、cca1突变体的叶片基角总体变化不大。在第6片莲座叶时，野生型Col-0的叶片基角为127.12°，而lhy、cca1突变体叶片基角分别为121.4°、123.52°，突变体的叶片基角都比野生型的要小，说明突变体VPC的发生时间要比野生型晚，延迟了VPC（表1）。

表1 野生型与突变体叶片基角的比较

2.3 茎顶端分生组织的结构特征

伴随着VPC的发生，茎顶端分生组织（shoot apical meristem,SAM）也会呈现不同的变化。结果显示，Col-0在生长第5 d时，SAM生长锥纵切面呈平坦状，细胞尚未分化（图2A），在生长第10 d时，生长锥纵切面稍有凸起，SAM的原套细胞为单层（图2B），在生长第15天时，生长锥明显凸起，原体和髓分生组织细胞分裂，数目增多（图2C），在第19天，生长锥继续生长、发育，凸起增高（图2D），在第23天时，花原基出现（图2E）；lhy、cca1突变体在生长第5天时，SAM纵切面也为平坦状，细胞无分化（图2F和图2K），在生长第10天和第15天时，生长锥纵切面也开始凸起，但茎尖分生组织原套细胞为单层或双层，细胞分裂数目增多但比野生型的少（图2G、图2H和图2L、图2M），在生长第19天时，生长锥纵切面凸起较为明显，原套、原体和髓分生组织均分化、发育（图2I和图2N），在生长第25天时，植株分化出12、13片叶，花芽发育（图2J和图2O）。根据野生型和突变体茎顶端生长锥明显凸起且分化的时间，判定突变体VPC延迟，与形态学观察结果一致。

图2 野生型Col-0和lhy、cca1突变体茎顶端分生组织结构

2.4 荧光定量PCR

miR156的检测结果显示，随着植株生长发育的进程，野生型和突变体植株中的miR156表达均呈下降趋势（图3）。在第11天时，miR156在突变体lhy、cca1中的表达量均比野生型的低；Col-0植株在生长第15天时，miR156的表达量下降最快，比第11天时测定的量下降1倍多，在此时发生VPC；而在第15天时，突变体植株降低的少，说明突变体VPC发生时间在第15天和第19天之间。这些结果表明突变体相对于野生型Col-0延迟了VPC，与本研究中的其他试验（包括表型及茎尖解剖观察）结果相符。

图3 Col-0与lhy、cca1不同发育过程中Q-PCR检测miR156表达

3 讨论

植物在生长发育过程中，不同的时期表现出不同的表型特征。植物生长发育过程中离不开VPC的关键作用，但是生物钟相关基因是如何影响VPC的，目前还尚未知晓。

在表型观察、解剖结构和分子水平上的试验结果表明，突变体lhy、cca1推迟了VPC发生的时间。野生型Col-0和突变体lhy、cca1分别在第6和第7、7片叶时发生VPC，突变体的VPC被延迟。此外，卢阳等[9]研究表明，突变体mgo3（CS8324）的莲座叶数目减少推迟了VPC的发生；而突变体amp1-1（SALK_034207）的莲座叶数目增多并未提前发生VPC，切除第1、2片真叶推迟了Col-0的VPC发生。本研究中，lhy和cca1突变体的莲座叶叶片总数都表现为增多，但其VPC延迟；推测突变体幼龄期产生的真叶受LHY、CCA1基因突变影响较大，数量较少，造成VPC发生延迟。在植株正常生长发育过程中伴随着叶片基角的变化，通过测量生长发育良好的野生型Col-0和lhy、cca1突变体莲座叶的叶片基角，结果也表明，突变体的叶片基角都比野生型的小，说明突变体由于发生基因突变导致了VPC的发生时间要比野生型晚，延迟了VPC。通过对野生型Col-0和生物钟相关突变体lhy、cca1的茎顶端分生组织的发育过程观察，能够清楚地了解其VPC的变化特征。结果表明，野生型Col-0在第15天左右发生VPC，而突变体lhy、cca1在第16天左右，比野生型发生的时间延后，说明突变体的VPC被推迟。通过观察SAM的发育变化，可以看到突变体SAM的原套、原体和髓分生组织发育延迟，且这种变化伴随着miR156表达量的改变。miR156检测结果也显示，野生型Col-0在第15天发生VPC，而突变体很可能在第16天发生，VPC延后，这也可以说明突变体的VPC被延迟。

研究表明，生物钟是复杂的计时系统，生成内源性周期近为24 h的节律，控制着动物睡眠或苏醒和植物的叶片运动、开花时间等活动。单一突变lhy与cca1，生物钟依然运转，说明LHY、CCA1是在生物振荡组件中发挥重要作用的必需组件。在LHY和CCA1中的紧密联系表明了它们具有功能冗余作用，在缺少CCA1时，LHY也能保持植物自身的节律[10]，但同时缺少LHY和CCA1时，植物自身生物钟则不能维持[11]。生物钟调控了包括开花在内的许多生物学过程[12]，lhy和cca1突变体VPC延迟的表型可能与其生物钟属性相关联。随着生长发育进程的推进，基因表达在24 h之间循环。可以推测，生物钟基因可能参与植物发育时相转变的网络调控，维持植物正常生长发育。

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