蛹虫草菌侵染柞蚕蛹条件的研究

2017-03-08张博孙宁孙永健通信作者张颖路雨何媛媛

天津农学院学报 2017年4期

张博，孙宁，孙永健，通信作者，张颖，路雨，何媛媛

蛹虫草（Cordyceps militaris（L.）Link）又名北冬虫夏草，是蛹虫草真菌寄生在鳞翅目昆虫蛹上形成的子座与蛹的复合体[1-3]。蛹虫草富含虫草素、虫草多糖等多种生物活性成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗衰老等功效，既可以作为治疗疾病的药物，还可以制成功能性食品和饮料，前景非常广阔[4-6]。在自然环境中，蛹虫草菌成功侵染虫蛹并萌发子实体，需要在特定气候及生态条件下完成，因此野生蛹虫草资源较为珍惜，不能满足日益增长的市场需求[7-10]。研究人员已从菌种选育、寄主选择、栽培条件、产品开发等多个角度对人工蛹虫草进行了相关研究，取得了较多成果[11-16]。本研究利用营养成分丰富、养殖技术成熟、一年可生发两代的柞蚕蛹（Antheraea pernyiPupa）为寄主，探讨人工培育蛹虫草过程中，菌种侵染柞蚕蛹的关键因素，以优化侵染方法。成果的应用可为快速、优质生产人工蛹虫草提供保障，保护野生蛹虫草资源。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

蛹虫草菌种为天津市工业微生物研究所提供。

1.1.2 试材

蔗糖、MgSO4、KH2PO4、VB1等化学试剂均为分析纯，购自天津风船化学试剂科技有限公司；新鲜滞育柞蚕蛹为市场采购。

GZX-150BS型光照培养箱、KYC-100B型恒温培养振荡器，上海圣科仪器设备有限公司生产；MJ-78A型高压蒸汽灭菌锅，上海巴玖实业有限公司生产；RZ-2D2G型双人桌面（水平）净化工作台，广州瑞智净化设备有限公司生产；FS-150N型超声波处理器，上海生析超声仪器有限公司生产。

1.2 试验方法

1.2.1 液体培养基的制备

称取马铃薯300 g，去皮后切成小块，加500 mL蒸馏水煮沸30 min，用4层纱布过滤取滤液。向滤液中加入 MgSO41.5 g、KH2PO43 g、VB110 mg、葡萄糖20 g，用蒸馏水定容至1 000 mL后分装于200 mL锥形瓶中（每瓶120 mL），每瓶加入20粒0.6 cm的玻璃珠，于121℃下灭菌20 min。

1.2.2 菌液的制作

按以下方法制作菌种，用灭好菌的接种针蘸取菌种，对清洗好的柞蚕蛹进行穿刺接种。

菌悬液法（A1处理）：用接种环将斜面菌种的菌丝刮下，置入装有50 mL无菌水的锥形瓶中，在无菌的环境下，用超声波处理器将菌丝震碎，制成菌悬液待用。

发酵菌液法（A2处理）：挑取黄豆粒大小的蛹虫草菌斜面菌种，接种于液体培养基。放置于摇床上进行避光振荡培养，设定温度为22℃，转速为120 r/min，3 d后选出菌液澄清、菌球长势一致且无畸形的栽培种继续培养2 d，在无菌条件下，用4层纱布过滤，取菌液待用。

改良发酵菌液法（A3处理）：按照方法二，将菌种培养于添加有柞蚕蛹浸出汁的液体培养基中（柞蚕蛹浸出汁∶液体培养基＝7∶3），经培养、过滤后，取菌液待用。

1.2.3 接种方式

将1.2.2中A3处理制作的菌种，按以下方法接种，考察接种方式对侵染的影响。

穿刺法（B1处理）：用无菌接种针蘸取菌液，扎刺柞蚕蚕蛹尾部上数第二节腹环处，刺破蛹壳即可。

注射法（B2处理）：用注射器吸取菌液，将针头平行地缓慢插入蚕蛹尾部上数第二节腹环处，注射菌液0.2 mL。

喷淋法（B3处理）：用菌液喷淋整个柞蚕蛹表面，将沾有菌液的蛹胸腹面向下，置于17℃的培养箱中培养1 d，重复此操作3次，后进行正常发菌培养。

1.2.4 柞蚕蛹的处理

用流动的水将柞蚕蛹清洗干净，晾干表面的水，按表1的方式对柞蚕蛹进行处理，采用1.2.3中的注射法将1.2.2中A3处理制作的菌种接种于蛹体，接种量为0.2 mL，考察柞蚕蛹的消毒方式对侵染的影响。

表1 柞蚕蛹的处理方式

1.2.5 栽培管理

接种好的柞蚕蛹，于17℃下培养至蛹体初步僵化，后将温度调整为24℃，培养至蛹体完全僵化。然后进行昼夜温差培养，日间给予600 lx的光照12 h，温度为22℃，夜间避光12 h，温度为16℃，空气湿度保持在60%～70%，培养10 d后原基开始形成。随后昼夜给予600 lx的光照，温度固定在22℃，空气湿度保持在80%～90%。当子实体尖端稍有膨大时，进行采收。

2 结果与分析

2.1 菌液对侵染及蛹虫草培育的影响

由表2可知，不同的栽培用菌种制作方式，对蛹虫草菌是否能成功侵染柞蚕蛹具有较大的差别。经过液体发酵活化后制成的栽培种（A2、A3处理），蛹虫草菌的侵染能力明显提高。其中，改良发酵菌液法（A3处理）较优，使得柞蚕蛹僵化率达到78.7%，而菌悬液法（A1处理）效果较差，僵化率最低，仅为61.3%。且A2、A3处理的子实体萌发率及蛹虫草的平均干重均高于A1处理，说明菌种经发酵活化后，对子实体的萌发及生长均有促进作用。由于改良发酵菌液法（A3处理）在液体培养基中添加了70%的柞蚕蛹浸出汁，可以使蛹虫草菌在发酵过程中先适应柞蚕蛹的营养成分，当接种之后，蛹虫草菌可以较快地进入快速生长期，从而缩短柞蚕蛹完全僵化所需的时间（22 d），因此确定改良发酵菌液法为较优的栽培种制作方法。

表2 菌液的制作方式对侵染及蛹虫草培育的影响

2.2 接种方式对侵染及蛹虫草培育的影响

由表3可知，采用喷淋法（B3处理）进行接种，柞蚕蛹僵化效果最好，僵化率可达91.3%，但蛹体完全僵化所需时间最长，为34 d，明显高于采用穿刺法（B1处理）与注射法（B2处理）进行接种的柞蚕蛹。经注射法接种后的柞蚕蛹，虽然僵化率低于喷淋法2%，但子实体萌发率及蛹虫草平均干重均高于其他两种方法，分别为91.8%与3.47 g，且蛹体完全僵化所需时间最短，仅为19 d。喷淋法在接种时不会给蛹体造成开放性损伤，从而避免了蛹体被其他杂菌感染而变质，但柞蚕蛹的外壳，阻碍了蛹虫草菌对其侵染，菌丝只能由外向内缓慢生长（图1）。而注射接种法促进了菌丝对蛹体的侵染，且接种量可控，培养时间短，对子实体的萌发及生长均有促进作用，因此确定为较优的接种方式。

表3 接种方式对侵染及蛹虫草培育的影响

图1 利用3种不同方法接种，完全僵化后的柞蚕蛹

2.3 柞蚕蛹前处理方法对侵染及培育的影响

由表4可知，在4种柞蚕蛹的前处理方法中，升汞处理（C2处理）后接种的150个柞蚕蛹中，仅有1个被杂菌感染，僵化率最高为99.3%。不经前处理（C4处理）的柞蚕蛹，僵化率最低，仅为88.7%，可见，经过消毒或灭菌处理后，蛹虫草菌对柞蚕蛹的侵染效果明显改善。但从蛹体僵化所需的时间、子实体萌发效果、蛹虫草平均干重来看，利用高温（C1处理）进行前处理的效果最佳，接种后，虽然僵化率略低于C2处理，但蛹体完全僵化所需时间最短，仅为6 d，僵化后，几

乎所有柞蚕蛹均萌发产生子实体，发草率高达99.3%，子实体长势健壮、颜色金黄，蛹体呈棕色（图2），蛹虫草平均干重在4种处理中最高，为3.54 g。这可能是由于利用升汞进行前处理，虽然可以起到较好的杀灭杂菌的效果，但由于重金属汞毒性较大及难以清除干净，会影响子实体的萌发及生长，造成子实体原基难以形成、生长缓慢、细弱矮小（见图2）。新洁尔灭消毒法（C3处理）虽然在一定程度上可以防止杂菌的感染，但同样会对子实体产生影响。因此确定高温高压灭菌法为较优的前处理方式。

表4 消毒、灭菌方式对蛹虫草培育的影响

图2 采用4种不同前处理方法培育获得的柞蚕蛹虫草

3 讨论

研究结果表明，对菌种进行活化后，采用注射接种的方法使其更直接、快速地进入寄主体内，会在一定程度上提高侵染效率；且不同的柞蚕蛹前处理方式，可在侵染效果上形成较大差别，柞蚕蛹经过高温灭菌后，减轻甚至完全消除了杂菌的影响，增强了蛹虫草菌对柞蚕蛹的感染能力，有效避免了坏蛹的出现，使蛹体完全僵化所需时间缩短至6 d，僵化率达到98%。通过对相关条件的探讨，既提高了蛹虫草菌的侵染能力，又缩短了培育周期，改善了产品品质，后续还可通过加强对蛹虫草菌种的选育来完善相关技术。

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