骨髓间充质干细胞来源外泌体与血液病诊断

杜 雪，郝梦哲，王 昶，夏 薇*

（1.北华大学医学检验学院，吉林 吉林 132013；2.吉林市中心医院，吉林 吉林 132001）

骨髓间充质干细胞来源外泌体与血液病诊断

杜 雪1，郝梦哲1，王 昶2，夏 薇1*

（1.北华大学医学检验学院，吉林 吉林 132013；2.吉林市中心医院，吉林 吉林 132001）

骨髓间充质干细胞（Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSC）外泌体是由BMSC分泌的囊泡物质，含多种生物活性物质，参与多种信息传递和调控，在血液病的发生发展中起重要作用。对其深入研究，可对血液病的诊断、监测和治疗提供实验依据。本文对BMSC来源外泌体检测及外泌体与血液病诊断进行综述。

间充质干细胞；血液病；外泌体；诊断

血液病在临床诊断上常检查血常规、骨髓细胞分析及骨髓病理活检等方法，而疑难血液病的骨髓细胞分布情况常给检验者带来诊断困难，多部位多次骨髓穿刺又会给患者带来极大痛苦。MSC源外泌体通过囊泡内外的信号分子在微环境中相邻细胞间进行信息交流，可以控制疾病进展，促进组织修复和免疫调节，在临床明确诊断和及时治疗方面有更深刻的研究意义。

1 外泌体

外泌体是多种细胞释放的内含多种生物活性物质的磷脂双层膜球形颗粒。在生理或病理条件下，MSC可分泌大小一致的外泌体，直径约40～100 nm的膜囊泡体。外泌体由细胞内陷成细胞内小体，在内吞体转运复合体及相关蛋白的调控下形成多囊泡体，在蛋白受体调节后经胞吐将多囊泡体分泌至胞外，参与细胞间的信息交流。目前外泌体分辨出近万种蛋白质ezrin、Tsg101、alix、Flotillin、Hsp70和多种Rab蛋白等，还含有大量核酸RNA，miR-711、miR-92a、miR-10a、miR-15a、miR-146a等。含核酸丰富的外泌体主要传递遗传信息，而核酸含量低的外泌体则会引起免疫反应。外泌体中miRNA和蛋白质的种类及数量可作为判定疾病的重要指标。

外泌体源性miRNA是一类长度为18～25 nt的小分子非编码RNA，其生物学性质稳定，作用于转录后水平的表达，将RNAs及其翻译产生的蛋白输送到靶细胞，调控细胞增殖与凋亡。外泌体中的tRNA片段（30～55nt）是抑制蛋白质翻译的潜在调制器，对MSC外泌体及干细胞相关的分类有一定作用，有助于了解BMSC如何影响邻近或远距细胞及其治疗后果[1]。

2 外泌体的检测

2.1 分离纯化

外泌体最常用提取方法是离心法，蔗糖密度梯度超速离心法得到富含外泌体的沉积物，经纯化后的外泌体纯度较高[2]。用免疫磁珠法模拟体内抗原抗体结合反应，将球型磁珠包被单克隆抗体与外泌体结合，此方法操作简单但是非体内环境会影响外泌体的生物活性与完整性。胡国文等发现了一种提取细胞外泌体的新方法：培养BMSC细胞，收集上清低速离心去除残余细胞及细胞碎片，采用旋转超滤技术提取外泌体不但结构完整且含量较高[3]。

2.2 鉴定分析

外泌体的鉴定分析常用方法包括电子显微镜、流式细胞仪和Western blot。应用可视化的电子显微镜观察所获外泌体一般为30～100 nm球状或扁平状，由于外泌体的体积小，流式细胞仪检测之前需要先把外泌体与抗体包被磁珠连接。根据外泌体来源细胞不同可选择耦合的磁珠也不同，目前常使用的抗MHC II类或抗CD63分析涂层珠。用Western blot检测外泌体蛋白表达量，表面标记物（如CD9、CD63、CD81），细胞骨架相关蛋白（如ezrin）和参与多囊生物合成的蛋白质（如Tsg101 and alix），其他蛋白有Flotillin、Hsp70和多种Rab蛋白等。动态光散射（DLS）是常用技术之一，用来估计颗粒的大小和蛋白质复合物的分子量，我们采用此方法评估外泌体的大小尺寸，分析其的尺寸分布强度图[4]。用PCR及测序的方法对外泌体遗传物质进行分析。

3 MSC来源外泌体与血液病诊断

3.1 慢性粒细胞白血病

慢性粒细胞白血病（chronic myeloid leukemia，CML）特异性CTL可诱导CML细胞株K562产生外泌体。MSC主要通过旁分泌作用将外泌体miRNA、mRNA和蛋白质运送到各相关通路参与信息传递和调控[5]。林晋对K562的外泌体功能进行研究，通过其调控基因miR-711干扰黏附分子CD44与CXCL-12表达，从而使造血干细胞的黏附能力下降。K562细胞释放miR-92a到细胞外环境转染cy3标记的pre-mir-92a，而cy3-mir-92a标记的信号CD63是K562细胞表达miR-92a 的标志物[6]。细胞表面受体CXCR4和CXCL12的相互作用介导白血病细胞趋化、迁移到微观领域内的骨髓，从而促进白血病细胞存活和增殖[7]。

3.2 骨髓增生异常综合征

骨髓增生异常综合征（Myelodysplastic syndrome，MDS）患者BMSC释放的外泌体被纳入造血祖细胞（HPC），通过微泡修改CD34+细胞特性，经miRNA修饰和CD34+细胞基因表达以及微泡导入之后的CD34+细胞克隆形成能力和存活率会提高。RT-PCR检测miR-10a和miR-15a在患者MSC外泌体中表达明显，被转移到CD34+细胞，改变TP53基因的表达。同时，TP53表达增强表明至少在某些情况下，MDS红系祖细胞的凋亡从TP53旁路途径介导微泡提供的微环境中可以被调解[8]。

3.3 多发性骨髓瘤

正常BMSC外泌体抑制多发性骨髓瘤（Multiple myeloma，MM）细胞的生长而MM BMSC衍生的外泌体促进MM肿瘤生长。MM患者BMSC释放外泌体转移到MM细胞进行细胞通信调节肿瘤生长，其肿瘤抑制基因miR-15a比正常人MSC源性外泌体含量少，具有更高含量的致癌蛋白、细胞因子和粘附分子[9]。这些外泌体中膜相关性Hsp70通过激活STAT3和STAT1通路直接诱导髓源性抑制细胞活化支持MM进展，增加抗凋亡蛋白Bcl-xL和Mcl-1表达[10]。MM细胞与MSC之间存在正反馈循环，MSC过表达miR-146a及多种细胞因子和趋化因子包括CXCL1，IL6、IL-8、IP-10、MCP-1的分泌导致细胞存活和迁移增强MM进展[11]。

4 展 望

研究表明BMSC外泌体对疾病具有抑制和促进的双重作用，患者BMSC产生的外泌体可以高效运输到靶组织，作为载体导入治疗药物既无伦理学限制又不会引起宿主的免疫反应[12]，因此BMSC外泌体的研究也可望用于疾病的治疗。研究外泌体中各种活性物质的作用机制和信息传递通路，遏制血液病的恶化和侵袭；对BMSC外泌体特异性生物标志研究，为恶性血液病靶向治疗提供新方法等都将给血液病的诊断治疗带来新的思路。

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本文编辑：赵小龙

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ISSN.2095-8242.2017.22.4352.02

吉林省科技厅重点科技攻关项目（20140204016YY）；吉林市科技局重大医疗卫生专项（2015334009）

夏薇