EVI1基因在儿童急性髓细胞白血病中的表达及意义

郑晨钰 温贤浩 郭玉霞 管贤敏 于 洁 肖剑文

重庆医科大学附属儿童医院 儿童医院儿科研究所 儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室（重庆 400014）

·论 著·

EVI1基因在儿童急性髓细胞白血病中的表达及意义

郑晨钰 温贤浩 郭玉霞 管贤敏 于 洁 肖剑文

重庆医科大学附属儿童医院 儿童医院儿科研究所 儿童发育疾病研究教育部重点实验室儿科学重庆市重点实验室（重庆 400014）

目的探讨EVI1基因表达与儿童急性髓细胞白血病（AML）临床表现及预后的关系。方法检测AML患儿EVI1基因表达，分析EVI1阳性AML患儿临床和实验室检查特点以及预后。结果145例AML患儿中EVI1阳性38例，占26.21%。与阴性组相比，阳性组患儿的年龄、性别、血红蛋白量、白细胞及血小板计数、细胞形态学FAB分型、异常核型检出率差异均无统计学意义（P＞0.05）；阴性组复杂核型检出率高于阳性组，差异有统计学意义（χ2=5.50，P=0.019）。38例阳性患儿中，14例化疗与7例异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）患儿的无事件生存（EFS）率差异有统计学意义（χ2=4.00，P=0.045）。阳性组与阴性组患儿化疗完全缓解率差异无统计学意义（91.67%对91.18%，P＞0.05），阳性组患儿复发率高于阴性组，差异有统计学意义（64.29% 对22.22%，P=0.009）；两组EFS率差异也有统计学意义（χ2=5.76，P=0.015）。2例阳性组患儿骨髓复发时EVI1基因仍阴性。结论EVI1基因是儿童AML的不良预后因素，allo-HSCT可改善EVI1阳性AML患儿预后。定量检测EVI1基因表达可能不适用于微小残留病监测。

急性髓细胞白血病； EVI1基因； 预后； 儿童

急性髓细胞白血病（acute myeloid leukemia，AML）是一种异质性很强的血液系统恶性肿瘤，目前认为克隆性染色体异常所形成的融合基因可干扰造血调控，在AML发生发展中起重要作用[1]。 EVI1（ecotropic virus integration site-1）基因是一种定位于人类染色体3q26的原癌基因，该基因可编码一种锌指蛋白并特异性地结合基因启动子DNA序列，其过度表达在AML发生和发展中起重要作用[2]。文献报道成人AML患者EVI1基因高表达提示预后不良，但儿童AML中EVI1基因表达及临床意义的报道不多[3,4]。本研究就EVI1高表达对儿童AML临床表现及与预后的影响进行探讨。

1 对象与方法

1.1 研究对象

以2012年12月至2015年12月重庆医科大学附属儿童医院血液肿瘤中心收治的145例儿童AML患儿为研究对象。入选标准：①年龄 5个月～ 14岁9个月；②均为首诊患儿；③所有患儿均经骨髓形态学、细胞组织化学染色、细胞免疫分型、细胞遗传学及分子生物学检测确诊。排除标准：治疗相关性白血病，21-三体综合征相关性白血病，慢性髓细胞白血病急性变，混合细胞性白血病及急性早幼粒细胞白血病，初诊时有中枢神经系统白血病，合并其他肿瘤或未按WHO-2008标准[5]完善检查者。入选研究对象根据初诊EVI1基因检测结果，分为阳性组（EVI1基因高表达）和阴性组（EVI1基因阴性）。

本研究得到重庆医科大学附属儿童医院医学伦理委员会批准并经患儿家属知情同意。

1.2 方法

1.2.1 临床资料收集 收集研究对象的性别、年龄、初诊血常规、乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）、骨髓检查结果及疗效等资料。

1.2.2 EVI1基因检测 骨髓涂片分类计数并结合组织化学染色（包括过氧化酶、糖原染色、非特异性酯酶及氟化钠抑制试验等）进行细胞形态学FAB分型；EDTA抗凝骨髓液采用4色流式细胞仪（FCM）进行免疫分型；骨髓液短期培养后G显带技术进行核型分析，参照ISCN2005标准进行核型描述[6]，染色体核型存在3种以上异常定义为复杂核型。骨髓分离单个核细胞提取RNA，采用多重巢式逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）检测包括EVI1基因在内的29种融合基因[7]。EVI1基因阳性者采用实时定量PCR（RQ-PCR）测定EVI1表达量，ABL作为内参[3]。 EVI1表达量= 2-ΔΔCt（ΔΔCt= ΔCt患儿- ΔCt正常人，ΔCt正常人= Ct正常人EVI1- Ct正常人ABL，ΔCt患儿= Ct患儿EVI1- Ct患儿ABL）。2-ΔΔCt≤ 8为EVI1阴性，8 ＜ 2-ΔΔCt≤ 32为EVI1阳性低表达，2-ΔΔCt＞ 32为EVI1阳性高表达。其他阳性基因使用单独RT-PCR复核确认[8]。

1.2.3 治疗方案及疗效评估 参考《儿童AML诊疗建议》[9]进行化疗和鞘内注射药物预防中枢神经系统白血病。①诱导化疗：2个疗程DAE方案，即柔红霉素（DNR）40 mg/(m2·d)，d1-3，静滴30 min；阿糖胞苷（Ara-C）200 mg/(m2·d)，d1-7，分2次，q12h，皮下注射；依托泊苷(VP16)100 mg/(m2·d)，d1-3，静滴3～4 h。②巩固化疗：3个疗程中大剂量Ara-C+DNR(或VP 16)：DNR 40mg/(m2·d)，d1-2，静滴30 min或VP 16 100mg/(m2·d)，d1-2，静滴3～4h；Ara-C2g/m22，q12h，d1-3，静滴2～3h或AraC1g/m2，q12h，d1-4，静滴2～3h；2个疗程HA方案，高三尖杉酯碱（HRT）3 mg/(m2·d)，d1-7，静滴30 min，Ara-C 200 mg/(m2·d)，d1-7，分2次，q12h，皮下注射。③强化化疗：2～3个疗程中大剂量Ara-C+DNR(或VP16)：DAR 40mg/(m2·d)，d1-2，静滴30min或VP16 100mg/(m2·d)，d1-2，静滴3～4h；Ara-C 2g/m2，q12h，d1-3，静滴2～3h或AraC1g/m2，q12h，d1-4，静滴2～3h。根据家属意愿，部分患儿接受异基因造血干细胞移植（allo-hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）。两次诱导方案后及巩固、强化阶段化疗前均行骨髓细胞学检查，使用FCM进行微小残留病（minimal resident disease，MRD）监测，MRD＜10-4定义为阴性[10]。RQ-PCR和RT-PCR技术分别检测EVI1基因和其他阳性基因表达情况[8]。1.2.4 随访 随访时间截至2016年5月30 日。中位随访时间25.65个月（0 ～ 50个月）。无事件生存（eventfree survival，EFS）期定义为从诊断到第1次事件（包括复发、在完全缓解期间死亡）或末次随访的时间。参照《血液病诊断及疗效标准》[11]，完全缓解（complete remission，CR）定义为骨髓增生活跃或明显活跃，白血病细胞＜5%；复发定义为骨髓白血病细胞≥20%。

1.3 统计学分析

采用SPSS 20.0软件对数据进行分析。计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用t检验；计数资料以百分比表示，组间比较采用χ2检验或Fisher精确概率法；生存分析应用Kaplan-Meier生存曲线，多组生存率的比较应用Log-Rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

145例患儿中男84例、女61例，平均年龄为（42.76±46.84）月（5个月 ～ 14岁9个月），其中38例检出EVI1基因且均为高表达（占26.21%），107例为EVI1基因低表达。与阴性组相比，阳性组初诊年龄、性别、血红蛋白量、白细胞及血小板计数的差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

2.2 骨髓检查

结合免疫分型，阳性组FAB分型以AML-M5型最为常见，与阴性组相比，AML各亚型分布差异无统计学意义（P=0.410）。见表2。

阳性组2例患儿未见分裂相；其余36例中，13例正常核型，23例异常核型（包括复杂核型10例），异常核型和复杂核型检出率分别为63.89%和27.78%。阳性组2例患儿3号染色体异常，分别为t(3;13)(q22;q13)和t(3;17)(p26;q23)。阴性组10例患儿未见分裂相；其余97例中，25例正常核型，72例异常核型（包括复杂核型49例），异常核型和复杂核型检出率分别为74.23%和50.51%。阴性组和阳性组的异常核型检出率差异无统计学意义（χ2=1.37，P=0.241），但阴性组的复杂核型检出率高于阳性组，差异有统计学意义（χ2=5.50，P=0.019）。38例阳性组患儿中，9例（23.68%）检出其他白血病基因，包括MLL/AF9（4例）、MLL/ AF1q（2例）、AML/ETO（2例）和CBFβ/MYH11（1例）。2.3 疗效分析

38例阳性组患儿中，1例确诊前死亡，13例放弃治疗，24例接受化疗。接受化疗的24例阳性组患儿中，21例首次诱导治疗后CR，3例未获CR患儿中2例接受第二疗程诱导治疗（1例CR），1例直接予allo-HSCT，诱导治疗共22例患儿CR（占91.67%）；22例诱导治疗获CR的患儿中2例放弃治疗，14例继续接受化疗，6例接受allo-HSCT。14例继续化疗患儿中，复发9例（骨髓复发8例，中枢复发1例），复发率64.29%；失访2例；中位EFS时间（11.00±15.70）月，3年EFS率为（41.10±0.16）%。7例接受allo-HSCT患儿均为外周血allo-HSCT（HLA相合同胞移植2例、无关供者1例、HLA半相合亲缘供者4例），复发1例，复发率14.29%，无治疗相关死亡，中位EFS时间（24.14±15.87）月。38例阳性组患儿中，14例化疗与7例allo-HSCT患儿的EFS率差异有统计学意义（χ2=4.00，P=0.045）。见图1。

107例阴性组患儿中，3例确诊前死亡，28例放弃治疗，8例按其他方案治疗，共68例接受与阳性组患儿相同诱导方案化疗。53例首次诱导治疗后CR；15例未CR患儿中12例接受第二疗程诱导治疗，9例CR，2例未CR，1例失访。诱导治疗共62例患儿CR（占91.18%），其中45例接受化疗，13例接受allo-HSCT，4例放弃治疗。45例化疗患儿中，骨髓抑制合并感染死亡4例，复发10例（骨髓复发9例、睾丸复发1例），复发率22.22%，失访4例，中位EFS时间（23.67± 15.40）月。

阳性组与阴性组患儿相比，化疗CR率差异无统计学意义（91.67% 对91.18%，χ2=0.00，P=1.000）；阳性组患儿复发率高于阴性组，差异有统计学意义（64.29% 对22.22%，χ2=6.83，P=0.009）；两组EFS率差异也有统计学意义（χ2=5.76，P=0.015）。见图2。

阳性组24例经诱导治疗后共22例达CR。CR患儿中15例行FCM-MRD检测，12例阴性，3例阳性；12例复查EVI1基因，8例阴性，2例阳性低表达，2例阳性高表达。阳性组14例单纯化疗患儿中共8例骨髓复发，复查EVI1基因2例阴性，2例阳性低表达，4例阳性高表达。阳性组接受allo-HSCT组移植的6例CR患儿中4例EVI1阴性，1例阳性高表达，1例阳性低表达；1例移植前未CR患儿为EVI1阳性低表达，1例移植复发患儿为移植前细胞学CR且EVI1阴性。

3 讨论

AML临床表现及预后差异较大。一般认为与儿童AML预后相关的危险因素包括诊断年龄、初诊白细胞计数及细胞遗传学改变等，其中特殊基因异常表达是重要的预后影响因子[9]。人类EVI1基因定位于染色体3q26，该基因高表达可抑制粒系细胞对集落刺激因子的反应，还能抑制转录因子GATA-1诱导的基因转录，阻碍红细胞生成素诱导的红系祖细胞分化，从而阻碍髓系细胞成熟分化[2]。

本研究显示，初诊AML患儿EVI1基因阳性高表达比例为25.50%，高于文献报道[3,4]，可能与本研究未纳入慢性髓细胞白血病急性变、急性早幼粒细胞白血病等有关。EVI1阳性患儿的发病年龄、性别、血红蛋白、白细胞及血小板水平与EVI1阴性患儿的差异无统计学意义，与文献相符[4]。EVI1激活常发生于AML的M0、M1和M2亚型[3]，但本组患儿除AML-M0外各亚型均有分布，AML-M5型最常见。本研究中染色体异常核型及复杂核型检出率分别达63.89%和27.78%，但与EVI1阴性组比较无显著差异。EVI1基因常见于t(3;3)(q21;q26)和inv(3q21;q26)，但本组患儿中仅2例检出3号染色体异常（占5.56%）且均非上述改变，提示缺乏3号染色体异常的AML患儿也可检出本基因[2]。本研究中合并其他白血病基因比例为23.68%，既有提示预后不良的MLL重排相关基因，也有提示预后较好的AML/ETO和CBFβ/MYH11基因[12]，而EVI1基因利用其两个含锌指样结构的区域与DNA发生作用并抑制启动子合成，提示EVI1基因可能通过调节其他基因表达而在AML的发生发展中起重要作用[13]。

本研究显示，EVI1阳性AML患儿诱导治疗CR率91.67%，与EVI1阴性组无差异，也与本中心前期研究（总CR率87.8%）结果相似[14]。但EVI1阳性组接受化疗患儿复发率高，EFS低于EVI1阴性组，中位生存时间仅13个月，相关研究也表明EVI1基因高表达提示儿童AML预后不佳[4]。本研究包括未CR在内共7例EVI1阳性患儿接受allo-HSCT，复发率14.29%，与EVI1阳性化疗组比较疗效有显著差异，相关研究也报道EVI1阳性且接受allo-HSCT的年轻成人患者2年EFS达47%[3]，提示allo-HSCT可提高EVI1阳性患儿生存率，且EVI1基因是否转阴可能不影响allo-HSCT疗效。

值得注意的是治疗后EVI1基因表达与细胞学和FCM检测结果不同步，化疗后细胞学及FCM均达CR的患儿部分仍有不同程度EVI1基因表达，而8例化疗后骨髓细胞学已达复发标准时仍有2例（25%）患儿EVI1基因为阴性。相关研究显示，AML复发时EVI1基因表达水平虽高于诱导治疗后但低于初诊时的表达[15]。以上研究均提示随访EVI1基因表达可能不能作为MRD监测指标。但本研究样本量较小，还需进一步扩大样本量、延长随访时间证实该推论。

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Expression of EVI1 gene and its clinical significance in pediatric acute myeloid leukemia

ZHENG Chenyu, WEN

Xianhao, GUO Yuxia, GUAN Xianmin, YU Jie, XIAO Jianwen
(Children’s Hospital of Chongqing Medical University, Pediatric Research Institute of Children’s Hospital, Ministry of Education Key Laboratory of Child Development and Disorders, Chongqing Key Laboratory of Pediatrics, Chongqing 400014, China)

ObjectiveTo investigate the relationship between EVI1 gene expression and clinical features and prognosis of children with acute myeloid leukemia (AML).MethodsEVI1 gene was detected in AML children, correlation of clinical and lab features, prognosis of AML children with EVI1 gene were analyzed.ResultsEVI1 expression is positive in 38 of 145 children with AML. There were no significant differences in age, gender, hemoglobin concentration, leukocytes and platelet count, subtype of morphology, ratio of chromosomal anomaly and complex karyotypes between EVI1 positive and EVI1 negative group (P＞0.05); coexist genes were detected in 9 cases (23.68%) of EVI1 positive group. Rate of complete remission (CR) was 91.67% in 24 cases of EVI1 positive patients received chemotherapy. Relapse rate was 64.29% and 14.29% in EVI1 positive patients who received chemotherapy and allo-hematopoietic stem cell transplantation (allo-HSCT), retrospectively and signi fi cant differences were found (P＜0.05). There was no signi fi cant difference in CR but signi fi cant difference was found in event free survival (P＜0.05) for EVI1 positive and EVI1 negative patients who received chemotherapy. EVI1 gene kept negative when bone marrow relapse occurred in two patients with EVI1 positive at diagnosis.ConclusionEVI1 gene may play adverse role in pediatric AML; prognosis of EVI1 positive AML patients can be improved by allo-HSCT; follow-up of EVI1 transcript levels is insuf fi cient to monitoring of minimal residual disease.

acute myeloid leukemia; EVI1 gene; prognosis; child

10.3969/j.issn.1000-3606.2017.05.003

2016-05-15)

(本文编辑：蔡虹蔚)

重庆市卫生计生委医学科研项目（No.2015msxm042）

肖剑文 电子信箱：tomahawk6502@sohu.com