口腔微生物群落及疾病相关性研究

周 爽，蔡 叶

（1.江苏省食品药品监督检验研究院，江苏 南京 210019；2.南京市口腔医院牙体牙髓科，江苏 南京 210001）

在人体口腔内寄居着数以亿计的微生物，它们与人体口腔保持着亲密且永久的关系，维持着口腔与微生物的动态平衡，在正常情况下，它们不会引起疾病，即口腔内的正常菌丛或固有菌丛。通常当机体与正常菌丛间维持相互平衡状态时，这些微生物显示对机体有益的作用；而当环境中某些因素破坏了这种平衡状态，如抗生素的长期使用，过量激素的使用或长期接触放射线等导致菌群失调，这些微生物群落就有机会显示其有害的作用[2]。

口腔内的正常菌丛是人体非特异性免疫因素之一，人体的皮肤黏膜和各种分泌液起到了物理屏障和化学屏障的作用，而正常菌丛对外来细菌的拮抗作用则是人体的生物屏障。口腔位于消化道的起始端，寄居于口腔中的微生物群落在口腔健康与疾病之间起着非常重要的作用，而一些特定的口腔疾病如牙周病、恶性肿瘤无法治愈或预测，因此更为详尽的口腔微生物群落研究为临床个体化的诊断、治疗甚至预防成为迫切的需要。

近年来，随着“下一代测序技术”的发展，“人类微生物组计划”及口腔微生物宏基因组学[3，4]等项目逐步开展，更多体外难培养的口腔微生物不仅得到了识别，群落数量和结构变化及其功能对口腔健康与疾病的作用得到了广泛的研究，进一步促进了口腔临床诊断和治疗的发展。

1 口腔微生物生态系的影响因素

口腔微生物生态系主要是根据菌丛分布的位置、形态及生理学特征分类的，一般分为四个：①龈上牙菌斑生态系；②龈下牙菌斑生态系；③颊上皮生态系；④舌背部生态系。每个生态系都有各自的特点，不同的菌丛也居住其中。例如龈上和龈下环境不同，龈上部位除了受机体咀嚼时机械力影响还受到唾液和含氧液体的洗涤，这些特点影响微生物在牙面上的附着；而龈下所在的龈沟液营养丰富，且牙周袋这一盲袋中基本很少受到机械力和液体的冲洗，使得龈下某些微生物得以生存甚至保护。微生物寄居于不同的环境表现出的特殊性构成了不同的口腔生态系，影响口腔生态系的因素一般有四大类：①物理化学因素：如口腔各个部位含氧浓度的不同、口腔中微生物寄居部位的等；②宿主因素：宿主的口腔状况，如唾液和龈沟液的组成成分影响寄居的微生物与宿主的关系；③细菌因素：微生物是否具有抵抗宿主防御系统的能力是以及对所附着的组织面是否有足够的亲和力，此外微生物之间的协同、拮抗作用也是维持口腔生态系的因素；④宿主可控制因素：如良好的饮食习惯，可以保持口腔卫生使菌斑的发育得到适当的控制，从而有利于口腔健康的维持[5]。

2 口腔微生物群落的结构

2.1 口腔微生物的来源

刚出生的婴儿口腔几乎是无菌的，出生后婴儿在不断的发生人与人、人与环境的接触中，逐步带菌。初生6小时之内婴儿口腔中仅发现数量极少的细菌，如大肠样埃希菌和链球菌等，均极可能来源于母亲的产道，出生6～10小时之间口腔的细菌极速增多。研究表明[6]，0～12个月所有婴儿口腔内均有链球菌、奈瑟菌和葡萄球菌，半数以上婴儿口腔中能分离到放线菌、乳杆菌和梭杆菌，半数1岁婴儿口腔中检出念珠菌、类大肠杆菌和棒状杆菌。在牙萌出前检不到对牙表面有亲和力的血链球菌和变形链球菌，牙萌出后，放线菌和梭杆菌的检出率增加。对学龄前儿童口腔微生物研究发现，除少有产黑色素的拟杆菌外其组成基本与成人接近，5岁儿童口腔中仅有18%～40%检出此菌，而且螺旋体的检出率也很低，但13～16岁儿童的口腔中可检测到产黑色素的拟杆菌，并且螺旋体的数量也随着年龄的增长而增加。中年后的牙龈和黏膜结构不如青壮年坚实，牙和牙龈以及黏膜的疾病较前增多。口腔内正常的微生物群落中的一些固有菌比例改变会导致内源性感染如龋齿、牙周炎等。老年人咀嚼器官老化、牙齿脱落使得与牙亲和力强的细菌如血链球菌、变形链球菌逐渐减少，在无牙颌的口腔中检不到这两种菌，而当口腔中装有义齿后，这些菌又出现在固有菌中。因此，口腔微生物群落的组成和变化均与宿主的年龄、饮食习惯、咀嚼器官的健全有着密切的关系。

2.2 口腔微生物菌丛的类型

2.2.1 固有菌丛（indigenous fl ora）

这些菌丛在数量上存在优势，常以较高比例（大于1%）存在于某些特殊的部位上（龈上或舌面），并与宿主之间保持平衡，宿主的体温以及饮食为它们提供的适宜的生长环境。固有菌丛中主要为放线菌、链球菌和奈瑟菌。

2.2.2 增补菌丛（supplemental fl ora）

一些常以低数量存在的常居菌（小于1%）在口腔环境改变时可能变为优势菌。如：当宿主发生牙周炎时，由于在牙龈下菌斑中螺旋体数量上升，牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线杆菌可对炎症和骨吸收起作用；同样，菌斑下乳杆菌属常以低水平存在，当发生龋坏时，pH降低呈偏酸性，乳杆菌中耐酸菌就在菌斑中显著上升。因此，菌斑中的增补菌丛包含了大量可能引起致病性的常居菌。

2.2.3 暂时菌丛（transient fl ora）

宿主在进食和饮水过程中带入的微生物会暂时存在于口腔中，这些细菌不具备与口腔环境抗争的机制。虽然它们如昙花一现，在牙菌斑中不表现致病性，但对医学研究尤为重要，因它们可能附着于肠道黏膜表面可由暂时菌转化为优势菌而引起肠道感染，是肠道感染的主要来源。

2.3 口腔微生物群落的多样性分析

口腔微生物组成复杂，种类繁多，信息量巨大，由口腔微生物引起的疾病逐渐增多，2008年全球第一个人体口腔微生物组数据库（Human Oral Microbiome Database,HOMD）在美国国立口腔与颌面研究所（National Institute of Dental and Craniofacial Research,NIDCR）建立，使口腔微生物学研究上了新的台阶。中国人口腔微生物组数据库（Oral Microbiome Database-West China School of Stomatology）由四川大学华西口腔医学院在多年口腔微生物学研究的基础上初步建立，旨在提供中国人口腔微生物物种、群落的全面信息，为研究中国人口口腔微生物学奠定了基础。

2.3.1 细菌

口腔中细菌的种属颇多，不同口腔部位的菌丛差异明显。Ahn等[7]利用16SrDNA测序技术分析了唾液中细菌的组成，发现11个门77种细菌，主要的细菌类别是厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、梭杆菌门和放线菌门。个体之间唾液的微生物组成可能相似，但具体还是存在差异的。其核心微生物主要是链球菌属、葡萄球菌属、放线菌属、微球菌属、奈瑟菌属、拟杆菌属、乳杆菌属、布兰汉菌属、韦荣菌属、棒杆菌属、芽孢杆菌属、梭杆菌属等。它们存在口腔的部位不同，生物学特性也各不相同，引起的致病性也不同。例如：变形链球菌常居于牙菌斑和唾液中，它细胞壁表面物质对牙面的定植作用很好，当口腔的pH值降低，呈酸性时，它的耐酸性使之在菌斑酸化和釉质脱矿中起作用，被公认为是主要的致龋菌。

口腔常居菌中还存在少量的的螺旋体和支原体。螺旋体分为5个属，主要是密螺旋体和疏螺旋体存在于口腔中，多为厌氧菌，内毒素可能是它们致病性的因素，如梭螺菌混合感染会导致急性坏死性溃疡性龈炎和备森咽颊炎。支原体在口腔中主要是Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型口腔支原体和肺炎支原体、唾液支原体等，它们多栖息在龈沟口腔粘膜和牙菌斑等部位，为口腔寄居数量较少的微生物，其与口腔生态系的关系及其致病性还不是很明确。

2.3.2 病毒

人类病毒种类较环境中病毒少，大多病毒分类尚不明确。潜伏于人类口腔的病毒是DNA和RNA两类病毒，多具有溶源作用，可能与口腔细菌的多样性有关。目前，研究分离得到的与口腔有联系的病毒不多，通过释放细胞因子在口腔疾病的发病机制中起重要作用。例如：大约在40%的健康人正常口腔粘膜中检测到人类乳头瘤病毒（HPV），尤以中年男性中占优势，它可引起疣和口腔鳞状乳头瘤；单纯疱疹Ⅰ型病毒（herpes simplex virus-Ⅰ）可引起面部和口腔病损；水痘带状疱症病毒是引起颌面部沿三叉神经分部的带状孢症病毒，EB病毒（EBV）是Slot等[8]在牙周炎组织中利用PCR技术提取DNA检测时发现的，在人群中分布广泛，大多数成年人对此病毒具有抗体，在初次感染后，潜伏于淋巴细胞中，是鼻咽癌，口腔舌缘毛状白斑等疾病的致病因子。

2.3.3 真菌

真菌不同于细菌，它是原核生物。近年来，临床上皮质激素和抗生素等药物的广泛使用，机体的正常菌丛平衡受到破坏，菌群失调使得机体的防御功能减弱，寄居于口腔中的真菌成为条件致病菌而导致真菌病。与口腔疾病相关的主要是酵母菌中的白色念珠菌，在正常情况下念珠菌很少引起疾病，只有在造成易感染条件时，如慢性局部刺激，头颈部放射治疗、口腔黏膜上皮发育不良，大量使用抗生素或激素、恶性肿瘤、植入修复体等，念珠菌可引致口腔念珠菌病。除上诉因素之外，年龄太小或太大的人群都易感染念珠菌病。

3 口腔微生物与健康的关系

口腔的慢性感染疾病，如牙龈炎、、龋齿、牙周炎和牙髓炎等都是口腔多菌种生态系统细菌间相互作用的结果。口腔微生物群落的组成和结构变化在疾病发生、发展过程中起着重要的作用，研究微生物群落组成作为预防、诊断、治疗口腔疾病的基础越来越为学者所重视。此外口腔疾病还与糖尿病、肿瘤、类风湿性关节炎、心血管疾病等全身系统性疾病密切相关。

3.1 龋病

龋病是最常见的牙硬组织感染性疾病，其引起牙体硬组织缺损的同时，还会引起牙髓和根尖周炎症。变形链球菌和S.sorbrinus在龋病的发生过程种起关键作用，随着龋病的发展菌群的组成和结构也会发生显著变化，变链菌不再是龋病的优势菌，而是由10个菌种组成的复杂的群落，除变链菌起调节作用外，韦荣氏球菌属、颗粒链球菌属、放线菌属、纤毛菌属、双歧杆菌、普氏菌属和硫单胞菌属均有调节作用[9,10]。研究唾液菌群的结构和功能可以作为预测龋病发生的标记[11]。徐建[12]等学者通过追踪研究儿童口腔不同位点菌群结构和功能，发现与龋病密切相关，并以此建模，提出了“龋病菌群指数”（MiC），根据该指数，不仅可以作为口腔健康的参数，而且在龋病发生之前可以预防口腔龋病的发生。

3.2 牙髓炎和根尖周炎

牙髓炎和根尖周炎时临床中最为常见的口腔疾病，发生于牙齿根尖周组织的感染，来源于龋病的纵深发展。目前发现G-厌氧菌在疾病的发生、发展中起重要作用，正常情况下，牙髓中没有炎性因子，当细菌及其代谢产物进入牙髓后，即出现炎症反应，因此根管系统定植的微生物是致病的主要因素。根尖周炎是根管内定植的微生物群落与宿主相互作用的结果，不同个体或感染部位不同也使感染根管的微生物群落呈现差异。目前是根尖周炎的主要治疗手段是根管治疗。然而，即使经过完善的根管治疗，仍有4%～15%的患牙无法治愈，发展成难治的根尖周炎，久治不愈的病例多伴有进行性骨质破坏和复发性根尖周脓肿。难治性的根尖周炎根尖区微生物的变异度较初次感染大，根尖区的微生物在根尖孔外表面定植，造成二次感染。在难治性根尖周区检测到包括牙龈卟啉单胞菌、丙酸丙杆菌、微小微单胞菌等在内的多种细菌[13，14]。目前发现[15]，粪肠球菌在难治性根尖周炎中的检出率高达10%～77.8%。此外，真菌在难治性根尖周炎中的作用日益关注，，白假丝酵母是持续感染根尖周炎根管中分离到的真菌，其在难治性根尖周炎的检出率高达7%～40%，它具有在恶劣条件下生存的能力。因此，根据根管填充前对根管内微生物组成进行分析，可以对患者罹患难治性根尖周炎风险进行评估，有针对性的采取治疗措施，可以提高患者的生活质量以及患牙保存率。

3.3 牙周病

牙周病是微生物感染引发的牙周组织损害和毁坏为特征的慢性疾病。研究表明[16-19]，一些G-，如牙龈卟啉单胞菌、牙髓卟啉单胞菌、复赛斯坦纳菌、拟杆菌、齿垢密螺旋体等被认为是牙周炎主要致病菌。徐建等学者[20-21]在比较口腔不同部位微生物群落分布特点的基础上，根据菌群信息建立了“牙龈炎菌群指数”（MiG），该指数在41名志愿者的验证群体中的准确性高达95%。此外，他们还发现因菌斑微生物组成不同而牙龈炎易感程度不同的两类人群，并且用6个细菌属构建了区分牙龈炎易感性的微生物模型，其区分易感人群的准确率高达74%[22]。大量研究表明，牙周炎是多种微生物感染所致，并非一种或多种微生物引起，因此，何金枝等[23]从微生物群落的整体出发，采用高通量和芯片技术，比较牙周炎患者和健康人群龈下菌斑的微生物群落组成，发现龈下微生物群落组成和功能基因的改变是引发、促进疾病的重要因素，为今后牙周炎的临床治疗提供了新的思路。

3.4 口腔癌

口腔癌是一种常见的愈后较差，毁容性恶性肿瘤，患者5年的生存率低于50%。研究发现[24]，微生物参与、诱导15～20%人体肿瘤的发生，口腔癌表面和癌体组织内发现有特异的微生物群落，其组成与正常口腔微生物有显著差异。口腔患癌者的唾液中，条件致病菌的丰度较健康人群明显增加。Pushalkar等[25]利用16SrRNA-DEEG技术成功分离了口腔鳞癌表面和内部的活菌，结果表明肿瘤微生态环境有利于一些条件致病菌的定植和存活，如口炎消化链球菌、唾液链球菌、溶血孪生球菌、密治安棒状杆菌显著增加。因此口腔菌群的筛查可以作为鳞癌筛查的潜在方法。口腔菌群可以参与口腔癌的发生、发展；肿瘤的发生还可以改变口腔部位的微环境，促使特定的细菌在肿瘤表面和内部的定植，同样，肿瘤的有效治疗可以使口腔微生物群落恢复到健康状态。

3.5 口臭

口臭排除消化系统疾病，主要是口腔微生物菌群失调引起的。牙周炎是引发口臭的重要原因，占口腔因素的58%，并且牙周炎的严重程度与口臭程度正相关。口臭患者口腔中唾液链球菌以及不可培养的真菌丰度较正常人高，此外舌背和舌苔上的细菌是引发口臭的重要原因，舌背上微生物类群主要是莫氏口臭独杆菌、殊异韦荣氏球菌、叶瘤杆菌；而舌苔上主要是韦荣氏球菌属、放线菌属、月形单胞菌属等[26,27]。此外一些厌氧菌、产硫化物菌的增加，口臭程度也会增加。

4 口腔宏基因组学

1998年Handelsman等[28]首次提出了宏基因组的概念，是指生态环境中全部微小生物及遗传物质的总和。宏基因组避免了传统的微生物分离培养方法，直接从样品中提取总的DNA，随后通过构建和筛选宏基因组文库来获得新的功能基因和生物活性物质。

传统口腔微生物学研究从口腔中某部位，如牙菌斑和龈沟液中采集样本进行培养，通过形态学和生理生化特征来鉴定微生物，这种方法对分析微生物的分类学地位和功能很有优势。但绝大多数的微生物无法得到纯培养，因此传统研究法对微生物种群之间的相互关系及功能束手无力。随着分子生物学技术进入微生态研究后，以DNA序列分析为基础的方法应用广泛，包括：核酸探针杂交技术、实时荧光PCR、末端限制性片段长度多态性分析（Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism，T-RFLP）、PCR-变性梯度凝胶电泳技术（PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis PCR-DGGE）、PCR-扩增片段长度多态性（PCR-amplified fragment length polymorphism，PCR-AFLP）等，这些技术可以在低丰度下检测口腔中一些目标菌或功能菌，其检测精确度好、分辨率高，但操作均比较烦锁，且专业化要求高，不足以满足整个口腔微生态环境的研究。测序技术的发展为口腔微生物宏基因组的研究带来了新的春天。

第一代测序技术基于Sanger提出的双脱氧核苷酸终止法，其通量低，耗时长、成本高。2006年后出现第二代测序技术，其核心思想是平行测序，可同时进行几十至几百万条DNA分子的测序。第二代测序技术测序范围广，检测限低,可检测正常存在的低丰度甚至痕量物种；序列读取可以定量化，杂交信号强度反应物种丰度信息；核酸条码可同时标记和测定多个样品。Ahn[29]等同时用罗氏454二代测序和口腔微生物鉴定芯片研究了口腔微生物群组，发现两种技术检测微生物群落具有高度的一致性和相关性。

2008年人类口腔微生物组数据库（human oral microbiome database,HOMD）[30]由英国国王学院和美国福赛斯研究所联合建立，对口腔微生物群落学研究具有划时代的意义。该数据库在16SrRNA序列分析的基础上研究微生物类群的发育树，到目前为止，共发现13个门619种口腔微生物分类群。这13门分别是：变形菌门（proteobacteria）、放线菌门（Actionbacteria）、衣原体门（Chlamydiae）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、广古菌门（Euryarchaeota）、绿弯菌门（Chloroflexi）、螺旋体门（Spirochaetes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、柔膜菌门（Tenericutes）、互养菌门（Synergistetes）、SR1和TM7（TM7是传统培养法未鉴定的菌属）。Zaura等[31]分析了3名健康个体口腔颊、牙面、舌、唾液、硬腭5个部位的微生物群落，发现颊面微生物多样性最低，牙齿邻面微生物多样性最高，3个个体中共同存在1660个序列，占测序内容的66%，说明个体间口腔微生物组成有重大重叠。多项研究表明[32，33]口腔微生物组具有独特的生物多样性，在个体间和个体内都存在差异性，但这些差异性较身体其他部位小，故口腔具有更核心微生物组。

口腔宏基因组学可以从微生物多样性、生态特征等角度揭示微生物与疾病的关系，从整体上比较健康和疾病状态下微生物结构与功能的差异，并通过基因构成展示微生物群落功能的改变，为口腔疾病的治疗和预防提供了新的靶点。

5 总 结

口腔微生物的结构、功能与口腔甚至全身的健康和疾病息息相关，宏基因组学的发展更使全面了解口腔微生物群落组成成为可能，同时也是精准医疗的基础。目前，口腔疾病和健康状态下的微生物功能基因组的差异，以及宿主的生活习惯、遗传背景和生平经历对口腔微生物组的影响还有待研究；未来，更完备的口腔微生物功能基因组，以及个体化的普遍测序手段和信息处理技术是发展方向，最终临床上实现个体化、精准化的预防和治疗手段也将成为可能。

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