2016年国内外蜂产品质量安全研究进展

周金慧 张文文 王欣然 张金振 金玥 杨树鹏 赵文 陈兰珍 问亚琴王鹏 黄京平 刘婷婷 李熠

（中国农业科学院蜜蜂研究所农业部蜂产品质量监督检验测试中心，北京100093）

2016年国内外蜂产品质量安全研究进展

周金慧 张文文 王欣然 张金振 金玥 杨树鹏 赵文 陈兰珍 问亚琴王鹏 黄京平 刘婷婷 李熠

（中国农业科学院蜜蜂研究所农业部蜂产品质量监督检验测试中心，北京100093）

本文通过查阅2016年国内外涉及蜂产品质量安全的研究论文和专利，分析了其在多个数据库的产品分类和研究热点分布情况，进而总结了该领域的最新研究进展。本文主要针对在蜂产品中农兽药残留分析、重金属分析、溯源分析、掺假鉴别等方面的能够提高分析效率、稳定性、准确度和灵敏度的新方法、新技术以及在原有技术上有较大改进的研究，展开简单的诠释和分析。通过探讨国内外最新的研究进展，能够深入、全面地了解同领域内的其他专家关注的焦点，为以后的研究提供更多的研究思路。

蜂产品，质量安全，农兽药残留，重金属分析，溯源分析，掺假鉴别

1 文献分布情况

截止至2016年12月初，从美国汤姆森科技信息集团（web of science）、谷歌学术（Google Scholar），爱思唯尔（Sciencedirect）、斯普林格（Springerlink）、EBSCO、美国分析化学协会（ACS）、英国分析化学协会（RSC）和Wiley等数据库搜索结果显示，2016年大约有169篇与蜂产品质量安全相关的英文文献被SCI期刊收录，涉及蜂蜜的有135篇，蜂胶20篇，蜂王浆6篇，蜂花粉4篇，蜂蜡3篇和蜂毒1篇（图1）。涉及的杂志主要包括Food chemistry、Food Analytical Method、Talanta、Journal of separation Science、Journal Food Additives&Contaminants、Journal of Chromatography A、Journal of Agricultural and Food Chemistry、Journal of the Science of Food and Agriculture、Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis和MethodX等。从中国知网（CNKI）、维普网（VIP）、万方数据知识服务平台（wanfangdata）和国家知识产权局检索数据库（SIPO）的搜索数据显示，2016年与蜂产品质量安全相关的中文学术文献约为74篇，其中涉及蜂蜜的有33篇，蜂王浆10篇，蜂胶18篇，蜂花粉13篇，蜂蜡、蜂毒没有报道，此外还有6项专利（图1）。主要涉及分析测试学报、分析化学、食品研究与开发、中国蜂业、食品工业、食品安全质量检测学报、蜜蜂杂志、光谱学与光谱分析、高等学校化学学报、质量探索、燕山大学学报、山东化工、广东化工、安徽农业化学、中国食品学报、食品研究与开发、食品科学、江苏调味副食品和食品工业科技等杂志。

2 研究进展

图1 2016年国内外蜂产品质量安全研究文献分布概况

2.1 农药和兽药残留分析

蜂蜜的研究主要包括外源污染物（农药、兽药、微生物和重金属）残留分析、内源组分分析、溯源分析以及掺假鉴别四个方面。农药和兽药残留分析类的文章主要集中于建立新的样品前处理方法和仪器分析方法，进而减少杂质干扰，提高痕量分析准确度和灵敏度的方面。重金属分析主要是利用原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、稳定同位素质谱法和电感耦合等离子体质谱法建立不同种类蜂蜜中各种元素的分析方法。此外还利用质谱技术对蜂蜜中芽孢杆菌进行鉴定与分型。内源组分分析主要是利用不同的仪器分析技术分析蜂蜜中的氨基酸、淀粉酶、糖类物质和脂肪酸。溯源分析主要基于蜂蜜的理化性质、挥发性组分、矿物元素、指纹图谱技术建立蜜源产地和蜜源植物的鉴别方法。而掺假研究主要是集中在蜂蜜中非法添加大米糖浆、淀粉糖浆或其他非法添加剂鉴别方法的开发。

中性解吸-电喷雾萃取电离质谱技术是利用斜对放置的进气管和样品管提取和净化待测样品，再将样品流引入电喷雾萃取电离源，带电液滴与样品液滴进行碰撞融合，发生液液萃取和电荷转移进而达到去溶剂的效果，最终对待测物进行质谱分析。该项技术已经用于蜂蜜中农药和兽药的残留分析。基于中性解吸-电喷雾萃取电离质谱，无需样品预处理即可直接检测蜂蜜中四环素，检出限为1.08 ng/ml。同时对市售蜂蜜进行检测，发现2种蜂蜜中含有痕量的四环素[1]。同样在无需样品预处理的条件下，利用该技术建立了蜂蜜中敌敌畏直接快速检测的方法，检出限为1.0 ng/ml(S/N= 3)[2]。该技术无需复杂的样品前处理，灵敏度高、精密度好、分析速度快且特异性强，能够耐受复杂基质的影响，是一种快速检测蜂蜜中四环素和敌敌畏的方法，同时也可为其他蜂产品中多种污染物的直接、快速分析提供借鉴和参考。

液液微萃取技术是微量萃取剂在分散剂作用下形成分散的有机微液滴，均匀的分散在样品水溶液中，从而形成水/萃取剂/分散剂乳浊液体系，目标分析物在水相和微量萃取剂之间达到萃取平衡，并最终分配到有机相中，离心分层，得到目标化合物。其优点是扩大了有机萃取剂和水相之间的接触面积，加快了萃取平衡的速度，使目标化合物迅速萃入萃取剂中，提高了萃取效率和富集倍数，集采样、萃取和浓缩于一体，萃取时间短，且方法准确、灵敏，是一种微量残留的快速检测方法。亲水的离子液体[N4444]Cl和离子交换试剂KPF6可形成疏水的[N4444][PF6]，从蜂蜜中提取苯甲酰脲类杀虫剂，提取后的溶液在室温下固化并利用滤膜过滤收集。该方法不需要分散溶剂、涡动混合、超声提取和离心等步骤[3]。分散液液微萃取技术也用于蜂蜜中有机氯农药的残留检测，1,2-二溴甲烷作为提取剂，乙腈作为分散剂，基于该方法可使有机氯的检测限和定量限分别达到0.004~0.07ng/g和0.02~0.3 ng/g，提取效率可达91~100%，富集因子范围为171~199[4]。氯苯作为提取溶剂，加入氯化钠作为分散剂并提高离子强度，然后通过优化萃取时间和溶剂量来提取蜂蜜中19种农药，最终利用气相色谱-质谱定量分析[5]。利用1,2-二溴乙烷作为提取剂，超声波辅助提取并恢复至室温，离心后从液滴中吸取样液定量分析蜂蜜中的毒死蜱和有机氯农药，该方法的检出限和定量限分别为0.003~0.06ng/g和0.01~0.2 ng/g，提取效率为91~100%富集因子范围为168~192[6]。此外，中空纤维液液微萃取法提取和净化蜂蜜中的磺胺类药物[7]，盐去乳化分散液液微萃取法提取和净化蜂蜜中的三嗪类除草剂[8]，涡动辅助的中空纤维液液微萃取法提取和净化蜂蜜中的阿苯达唑和三氯苯咪唑[9]，固相萃取结合液液微萃取法提取和净化蜂蜜中的溴氰菊酯和氯菊酯[10]等，均为在传统的液液微萃取技术基础上采取微小的技术改动，从而达到更好的提取和净化效果，并广泛应用于蜂蜜中农药和兽药的残留检测。

QuEChERS(quick,easy,cheap,effective,ruggedand safe)技术已经在农药和兽药残留研究中得到了广泛应用。Hsiang等[11]利用酸化乙腈溶解蜂蜜样品，无水硫酸钠和氯化钠用于提取样品中的酰胺醇类药物，上清液采用无水硫酸钠、C18粉、C18封端吸附剂和QuE ZSep填料净化杂质，串联质谱定量。蜂蜜中硝基呋喃和硝基咪唑类药物多残留分析采用优化过的QuEChERS技术进行提取和净化，乙腈提取后，加入硫酸镁和氯化钠涡动混合净化杂质，上清液进行衍生化，氮吹复溶后串联质谱分析[12]。此外，该技术还广泛应用于多种农药的残留分析，其关键点在于针对不同的污染物选择不同的提取剂和净化填料，并对使用量进行优化[13,14]。

酶联免疫技术尤其是试剂盒方法在蜂蜜中兽药的筛查取得了显著的效果。利用四环素类药物作为半抗原偶联蛋白后制备单克隆抗体，同时然后利用柠檬酸钠还原法制备胶体金，进而制备胶体金标记单克隆抗体生产试纸条。利用基于试纸条的免疫色谱法快速定性和定量分析蜂蜜中残留的四环素类药物[15]。

分子印迹技术是指当模板分子（印迹分子或代测物）与聚合物单体接触时会形成多重作用点，通过聚合过程这种作用就会被记忆下来，当模板分子除去后，聚合物中就形成了与模板分子空间构型相匹配的具有多重作用点的空穴，这样的空穴将对模板分子及其类似物具有选择识别特性。基于亲水分子印迹树脂建立了蜂蜜中三嗪类除草剂的液相色谱串联质谱法，其中利用间苯二酚和三聚氰胺作为双功能单体，甲醛作为交联基团，莠灭净作为模板缩聚合成分子印迹树脂。该方法检测限范围可达0.02~0.15 ng/g，回收率范围为83± 4~97±4%[16]。Madiha等建立了基于免疫印迹技术的生物传感器检测蜂蜜中残留的四环素，苯胺功能化的金纳米颗粒通过电聚合制备分子印迹聚合物，检测限可达2.24×10-16M，回收率范围为101.8~106.0%，相对标准偏差小于8.3%[17]。

电化学技术在污染物的定量分析中也得到了广泛的应用。电极传感器技术包括差分脉冲，方波和吸附溶出伏安法已经在污水、河水、人尿、制药和牛奶样品中四环素测定方面取得一定的研究进展。锑膜微电极传感器技术也可应用于蜂蜜中四环素类药物的残留检测，首先利用方波阴极溶出伏安法和玻璃碳电极制备锑膜电极传感器，基于高效的Draper Lin组分设计方法优化pH值和锑浓度等参数，最终在0.40～3.00 μM浓度范围内检测限可达0.15 μM[18]。此外利用垂直二氧化硅的二元组装改性的氧化铟锡电极介电膜和圆柱形表面活性剂胶束结合的电化学检测技术可检测蜂蜜中残留的氯霉素。在直径为2～3nm的硬电极介电膜支持和限定的十六烷基三甲基溴化铵的软表面活性剂胶束，其具有能够从样品溶液中提取和浓缩亲脂性有机物质中碳氢化合物的能力。因此，表面活性剂胶束和电极介电膜修饰的电极表现出的针对氯霉素的分析能力优于裸露和垂直硅孔道修饰的电极。在优化条件下使用差示脉冲伏安法获得用于氯霉素分析的两个线性动态浓度测定范围，即0.1～3.6 mg/kg和3.6～15.0mg/kg，并获得了检测低限40μg/kg[19]。

蜂王浆和蜂胶中的污染物残留也是不容忽视的问题。利用快速溶剂萃取-凝胶渗透色谱净化-液相色谱串联质谱法能够提取、净化并定量测定蜂花粉中硝基咪唑类化合物，样品以乙酸乙酯为萃取溶剂经快速溶剂萃取仪萃取，凝胶渗透色谱(GPC)净化，采用Zorbax Eclipse Plus C18色谱柱分离，以0.15%甲酸溶液(A)-甲醇(B)为流动相。质谱采用多反应监测正离子扫描模式，基质匹配标准曲线同位素内标法定量。硝基咪唑类化合物检出限为1.5μg/kg，定量限为5.0μg/kg[20]。蜂蜜和蜂王浆中四环素残留检测方法较多也相对成熟，但是蜂胶中的报道较少，这是由于蜂胶基质非常复杂，含有大量的黄酮和酚酸类物质等，分析过程中受基质的影响很大，导致分析结果准确度下降，所以蜂胶中抗生素的检测方法有待进一步的研究和发展。研究中发现，采用Mcllvaine缓冲溶液提取蜂胶中的四环素残留，以结构和性质相似的地美环素和甲烯土霉素作为四环素类目标物的内标，采用Oasis HLB柱净化杂质，通过分析比较提取液、内标的选择对试验结果的影响，确定试验方法的线性范围和定量限，建立的高效液相-质谱联用法，回收率在74.1～118.8%之间，RSD＜15%，能够满足蜂胶产品中四环素药物残留的常规检测要求[21]。

2.2 金属元素分析

金属元素通常根据密度大小分为重金属、轻金属和准金属元素等。蜂产品本身就含有铁、钙、铜、钾等多种有益人体健康的微量元素，此外由于我国土壤和环境中的重金属污染日益严重，所以蜂产品中也经常残留铅、砷和汞等对人体有极大危害的重金属元素。目前测定蜂蜜中元素的方法主要有基于微波消解法的原子吸收光谱法、原子荧光光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法。采用微波消解法同时提取蜂蜜、蜂王浆、蜂胶和蜂花粉中的铅、砷、汞，铅的赶酸温度为160℃，砷、汞的赶酸温度为110℃，该温度条件既能防止汞的挥发，又能有效提高工作效率[22]。椴树蜂蜜是我国东北地区特色蜜种，采用湿法消解处理椴树蜜样品，电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）法测定铝元素含量，称取椴树蜜试样于高硼硅消解管中，加入硝酸置于电热消解仪上预处理，然后升温至120℃消解2h，其后将样品在150℃消解至澄清透明，赶酸后将样品转入50ml容量瓶中，定容摇匀，回收率在95.83～115.50%之间，线性相关系数为0.9999，RSD＜2.62%。该方法测定快速准确，适于蜂蜜中铝元素的测定[23]。应用微波消解-电感耦合等离子体质谱(ICPMS)分析椴树蜂蜜样品，取蜂蜜样品于离心管中，在水浴中超声处理，直到蜂蜜样品呈清澈液态，然后将蜂蜜样品置于酸煮洗净的中压消解罐中，加入硝酸和双氧水，旋紧顶盖放入微波消解仪内，按照设定的消解程序进行微波消解。消解完毕后，待样品冷却至室温，打开消解罐，将消解液转移至离心管中，并用去离子水洗涤消解罐及盖子3次，合并洗液至离心管中，定容至刻度，混匀，待测分析。每次消解过程中均同时制备空白试样和标准物质试样。使用该方法可同时测定椴树蜂蜜中23种元素的含量[24]。为解决电感耦合等离子体质谱仪测定蜂王浆中硒含量时产生的干扰问题，应用动态反应池（DRC）技术，通过对反应气种类、流量及测定元素同位素的优化，确定了消除干扰的方法。实验结果表明，当以78Se为分析物，甲烷（CH4）为反应气时，可有效降低干扰[25]。蜂胶中常见重金属铅(Pb)、砷(As)、汞(Hg)、镉(Cd)和铬(Cr)的分析过程中的非质谱干扰主要源于样品基质效应进而影响ICP-MS分析中许多过程，如气溶胶的产生、气溶胶的引入离子在接口处的提取和正离子束在质谱中间的传输等复杂过程。通过选择合适的内标元素以尽可能地消除非质谱干扰。分析过程中的质谱干扰主要源于不能分辨相同质量物质的干扰，包括同量异位素干扰、多原子干扰以及双电荷离子干扰等。通过选择无干扰的待测元素同位素、引入He碰撞反应池技术以及减少含水量、降低样品和载气流速等优化工作条件，以减少在等离子中形成干扰[26]。

（未完待续）

国家蜂产业技术体系专项资金资助(CARS-45)。

李熠，研究员，从事蜂产品质量安全研究与评价工作，E-mail:bricaas_liyi@126.com