缬沙坦对糖尿病肾病大鼠足细胞相关蛋白TRPC6的影响

李 礼，王彩丽*，米 焱，冯 涛

（内蒙古包头医学院第一附属医院，内蒙古 包头 014010）

瞬时受体电位阳离子通道亚型6（TRPC6）为新近发现的与蛋白尿发生密切相关的重要的足细胞膜蛋白，在肾小球中其主要表达于裂孔隔膜（slit diaphragm，SD）附近。糖尿病肾病（DN）作为终末期肾衰竭的主要病因，一直为临床上的治疗难点，而蛋白尿是促进肾小球硬化的独立危险原因，促进肾脏病的发展，所以说减少DN蛋白尿、研究导致糖尿病肾病蛋白尿的发生机制是近几年的研究热点[1]。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁健康的40只雄性SD大鼠体重180～200 g。

1.2 药物和试剂

缬沙坦由北京诺华制药有限公司提供、链脲佐菌素、Trizol、PrimeScript TMRT Master Mix、RNA PCR Kit（AMV）（TaKaRa，大连）。

1.3 糖尿病大鼠模型的制备与分组情况

将40只雄性SD大鼠分为成两个组别：正常对照组设置为NC组，数量为7、糖尿病肾病模型组，数量为33。全部模型均禁食过夜，糖尿病肾病模型组实施一次性腹腔注射链脲佐菌素（STZ）40 mg／kg，72小时后，测量大鼠的尾血随机血糖，间隔一天测量其血糖水平，4周后测量其24小时尿蛋白定量，如果模型的随机血糖水平连续2周大于16.7 mmol/l、24小时尿蛋白定量≥30 mg[3]，即可判定为建立糖尿病肾病模型成功。随后对糖尿病肾病模型组依据体重情况再次实施分组：糖尿病肾病设为对照组（DN组，数量为11）、缬沙坦干预组H0组[10 mg/（kd·d），数量为11）]、缬沙坦干预组H1组[30 mg/（kd·d），数量为11）]，缬沙坦干预组模型连续用药8周。

1.4 RT-PCR方法检测TRPC6 mRNA表达

应用经典的Trizol法对肾脏组织总RNA进行采集，使用反转录试剂盒反转录RNA成cDNA，RT体系（10 μl）：Master Mix（2 μl）、RNA（6 μl）、ddH2O（2 μl）。

TRPC6扩增体系如下：cDNA 2 μl，Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）（2×）12.5 μl，PCR Forward Primer（10 μM）1 μl，PCR Reverse Primer（10 μM）1 μl，DEPC水8.5 μl，终反应体系25 μl。反应的条件为：在95℃温度下进行预变性，在温度为95℃的环境下实施变性，在温度在58℃中退火，72℃延伸，共计30个循环，最后在温度是72℃的环境下进行延伸。PCR产物在温度是4℃的环境中进行保存。

取PCR产物5 μl和marker 5 μl，然后分别点样在2%的琼脂糖凝胶中实施电泳操作，经过20分钟后，在紫外光灯下进行结果的观察。把电泳后凝胶放在凝胶成像分析系统中，实施阳性条带吸光度扫描并准确记录结果，使用betaactin作为内参照校正，目的基因的吸光度和beta-actin吸光度的比值就显示的是目的基因的相对表达量。

1.5 统计学分析

应用统计学软件GraphPad Prism5对本实验数据进行统计分析，统计程序为单因子方差分析（one-way ANOVA）和相关分析（Correlation）。数据以±s表示。P＜0.05表示对比组之间的差异具有统计学意义。

2 结 果

干预8周后，应用计算机定量实施分析后显示，和NC组进行对比，DN组的TRPC6 mRNA表达为上调，经过比较，有显著的统计学差异（均P＜0.05）；和DN组进行对比，H1组及H0组TRPC6 mRNA表达都显示为下调，经比较，有显著的统计学差异（均P＜0.05）；H1组和H0组进行比较，TRPC6 mRNA表达发生下调，经比较，有显著的统计学差异（均P＜0.05）。

3 讨 论

目前有相关的研究结果显示：TRPC通道参与了DM的发展过程。在2005年，Winn等首次报道了TRPC6基因突变产物会造成大量蛋白尿出现。本实验通过RT-PCR方法显示DKD大鼠足细胞裂孔膜分子TRPC6基因水平表达呈现不断增加的趋势，这个研究结果显示：过度表达TRPC6会导致蛋白尿的出现，证实了TRPC6和蛋白尿是有一定的联系的[2]。通过缬沙坦对TRPC6的表达进行抑制，对临床对蛋白尿的控制措施的制定是有帮助的。说明缬沙坦在一定范围内，其肾脏保护作用呈剂量依赖性[3]。

[1] 任直亲,范 慧,李芳芳.缬沙坦对糖尿病肾病大鼠肾脏TRPC6表达的影响[J].糖尿病新世界,2016,19(11):48-49.

[2] 王彦江,谢席胜,王宝福,等.足细胞TRPC6与糖尿病肾病蛋白尿发生机制的研究新进展[J].中国中西医结合肾病杂志,2012,13(8):747-749.

[3] 李 礼,王彩丽.足细胞TRPC6与糖尿病肾病相关的研究进展[J].医学综述,2014,20(5):872-874.