五苓散对实验性铜中毒大鼠的治疗作用

程 颜，刘亚云，张方洁，黄翠华，康佑汐，韩春杨，陈玎玎，刘翠艳，*

(1. 安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036； 2. 安徽农业大学 生物技术中心，安徽 合肥 230036)

五苓散对实验性铜中毒大鼠的治疗作用

程 颜1，刘亚云1，张方洁1，黄翠华1，康佑汐1，韩春杨1，陈玎玎2，*，刘翠艳1，*

(1. 安徽农业大学 动物科技学院，安徽 合肥 230036； 2. 安徽农业大学 生物技术中心，安徽 合肥 230036)

为探讨中药利湿方剂五苓散对动物体内铜排泄的影响，通过饲喂高铜饲料建立SD大鼠亚慢性铜中毒病理模型，然后用五苓散进行治疗。分别在造模成功和治疗结束时进行心脏采血，火焰原子吸收法测定大鼠血液铜含量，试剂盒法测定血清中AST、LDH和SOD的活性；试验结束时剖杀大鼠，观察内脏器官的病理变化，并取肝脏、肾脏进行组织病理学检查。造模结束时检查发现，与对照组相比，模型组大鼠体质量增长速度减缓，肝脏和肾脏出现明显的病理学变化，血液铜含量极显著升高(P<0.01)，说明造模成功。采用五苓散治疗后，与模型组比较，治疗组大鼠肝肾病理学变化明显减轻，血液中铜含量显著降低(P<0.05)；SOD活性升高(P<0.05)，AST和LDH活性降低(P<0.05)；与空白对照组比较，治疗组大鼠上述指标均无显著差异(P>0.05)。上述结果表明，五苓散能有效促进铜中毒大鼠体内铜的排泄，减轻肝、肾组织损伤，可用于临床动物亚慢性铜中毒的治疗。

五苓散；大鼠；铜中毒；治疗

铜是动物机体必需的微量元素之一，其最重要的生理作用是作为金属酶的组成部分参与体内代谢，在保证动物健康生长和提高生产力方面起着不可替代的作用。自1955年Barber等[1]提出“在生长肥育猪的日粮中添加高于正常生理需要数10倍量的铜可促进生长及改进饲料利用率”后，铜开始作为一种畜禽促生长剂被广泛使用，而且其使用剂量往往超出畜禽本身最大耐受量。不可忽视的是，铜还是一种有毒元素，美国EPA(美国环境保护署)将铜列为第4类优先考虑的毒性元素。长期使用高铜饲料，除了可能引起动物铜中毒外，还会因高铜降低锌和铁的吸收，从而引起锌和铁的缺乏，导致动物肝、肾中铜残留量显著增加，从而影响动物性食品安全，危害人类健康。因此，除了制定法令法规限制铜在饲料中的使用外，促进动物体排铜也是一个重要方面。

目前，对于食用动物慢性铜中毒基本不治疗，国外有报道称醋酸锌是一种有效、无毒的治疗犬铜中毒的药物[2]。在人医临床上，铜中毒病人的抢救除支持疗法和对症治疗外，主要用二巯基丙磺酸钠和青霉胺进行治疗或采用白蛋白透析[3]，但这些方法目前在兽医临床上尚未采用。另外，西药治疗多为对症治疗，需要不同药物的相互作用，从而增加机体代谢负担；有时还导致机体对其他元素的摄入量增加，而铜中毒时机体本身对这些元素的代谢是降低的，从而导致其他疾病发生的概率增大[4]。中药源于天然，毒副作用小，不易产生耐药性；而且中药治病不仅仅是治疗某一种病症，更重视机体内环境的调节，因而更适合人和动物疾病的治疗。中药方剂五苓散具有温阳化气、利湿行水的功效，与铜中毒证治相合，可用于铜中毒的治疗，但目前有关中药排泄重金属的研究和应用还不够广泛和深入，因此本研究尝试采用利湿方剂五苓散对大鼠实验性铜中毒进行治疗，以期为医学尤其是兽医学临床应用提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠30只，雄性，5周龄，体质量(100 ± 5)g，购自江苏爱尔麦特科技有限公司，动物许可证号为SCXK(苏)2014-0007。

1.2 主要试剂与仪器

谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒：均购自南京建成生物工程研究所；铜标准贮备液(1 000 mg·L-1)：购自国家有色金属及电子材料分析测试中心；硝酸、高氯酸为优级纯；实验用水为电阻值18.2 MΩ的超纯水。

BSA124S-CW型电子分析天平，由北京赛多利斯有限公司生产；CelercareV1型全自动生化分析仪，由天津微纳芯科技有限公司生产；RE52CS旋转蒸发仪，由上海亚荣生化仪器厂生产；BA200型数码显微镜，由厦门麦克奥迪实业集团有限公司生产；石蜡切片机，由德国Sigma公司生产；ZEEnit700P原子吸收光谱仪，由德国耶拿公司生产。

采样瓶与分析器具处理：采集水样的聚乙烯塑料瓶及实验用的玻璃器皿必须用洗涤剂洗净后，在硝酸溶液中浸泡，反复冲洗，使用前用去离子水润洗1～2次。

1.3 SD大鼠慢性铜中毒模型的建立及五苓散治疗试验

1.3.1 五苓散水煎液的制备

取干燥的五苓散饮片128 g(猪苓、泽泻、白术、茯苓、桂枝的质量比为3∶5∶3∶3∶2)，制成粗粉；加8倍量去离子水浸泡40 min；武火煮沸后，改用文火，保持微沸40 min；纱布过滤；药渣再加5倍量温水煎煮，小火保持微沸30 min，过滤；合并2次煎液，958g离心15 min，旋转蒸发仪浓缩至256 mL(相当于含生药0.5 g·mL-1)，高压蒸汽灭菌，4℃冰箱保存备用。

1.3.2 处理设计

将30只大鼠随机分成3组，即对照组、模型组和五苓散治疗组，每组10只。对照组饲喂普通饲料，模型组和五苓散治疗组饲喂高铜饲料(Cu含量700 mg·kg-1)，连续饲喂28 d，期间自由饮水。每天记录各组大鼠的精神状况、形态体征、采食饮水情况等，每周称量体质量1次。造模成功后，治疗组按每kg体质量3.125 g的剂量(此为前期摸索出的最佳剂量)给大鼠灌胃五苓散煎液，对照组和模型组给予等量去离子水，每天2次，连续10 d。

1.3.3 样品采集

大鼠于最后1次给药后禁食12 h，不禁水。实验时先称量，再以乙醚吸入麻醉，心脏采血，收集3 mL抗凝血，2 mL非抗凝血；然后颈椎脱臼处死大鼠，进行病理剖检，观察内脏器官的变化，并取肝、肾等组织，以4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液(pH 7.4)固定。

1.3.4 火焰原子吸收分光光度法检测大鼠全血铜含量

(1)血样前处理。准确吸取2 mL待检全血于50 mL烧杯中，加入8 mL硝酸和2 mL高氯酸，充分混匀，加盖表面皿，置于60 ℃烘箱内过夜。次日于电热板上加热消解，直至清亮透明冒白烟，再进一步消煮至尽干。取下烧杯，冷却，用超纯水定容至10 mL，待测。同时进行空白样品的处理。

(2)铜标准工作液的配制。吸取铜标准贮备液1 mL，用0.5%的硝酸定容至100 mL，制得浓度为10 mg·L-1的铜标准中间液。再从中分别吸取1、3、5、7、9 mL，定容至100 mL，即获得0.1、0.3、0.5、0.7、0.9 mg·L-1的系列标准工作液。

(3)原子吸收光谱仪的工作条件。分析波长：24.8 nm；灯电流：3 mA；狭缝宽度：1.2 nm；原子化方式：火焰；火焰类型：C2H2/Air；火焰高度：6 nm。

1.3.5 大鼠血清SOD、AST、LDH活力测定

将全血样品958g离心20 min，分离血清。按试剂盒说明书，用全自动生化分析仪进行血清样品中SOD、AST、LDH的活性测定。每个样品3个重复。

1.3.6 肝、肾组织的病理学观察

将固定于4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液中的肝脏、肾脏等组织，进行石蜡切片，HE常规染色，显微镜观察其组织学变化。

1.4 数据处理

实验数据以平均值±标准差表示，采用SPSS 19. 0 软件包中多因素方差分析及Duncan法进行统计检验。P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 临床症状观察及体质量变化

随着高铜饲料喂饲时间的延长，模型组大鼠表现为形体消瘦、被毛焦燥、颜色发黄。在体质量方面，对照组和模型组大鼠初质量均为(100 ± 5) g，第1周称量两组体质量差异不明显(P>0.05)，第2周至第4周称量两组体质量差异显著(P<0.05)，模型组大鼠体质量增长速度较正常对照组明显减慢(表1)。

2.2 病理剖检

模型组大鼠：肝均质脆，发黄，肿胀明显；肾脏肿胀，呈巧克力色；肺部有充血；肠道中的粪便稀薄发绿。

治疗组大鼠：肝脏略黄，肿胀不明显；肾脏稍软，略肿或不肿；肺和肠道未见明显异常。

表1 大鼠喂高铜饲料期间体质量变化

Table 1 The changes of body weight of rats in two groups after treated with different level of Cu g

同列数据后无相同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下同。

Data marked without the same lowercase letter in each column indicated significant differences atP<0.05. The same as bellow.

2.3 血液中铜含量测定

2.3.1 造模结束时对照组、模型组大鼠血液中铜含量的变化

造模结束时，模型组大鼠血液铜含量为(1.058±0.019) μg·g-1，显著高于对照组大鼠血液铜含量(0.793±0.112)μg·g-1(P<0.01)，说明造模成功。

2.3.2 五苓散治疗后各组大鼠血液中铜含量的变化

由表2可知，用五苓散治疗后，治疗组大鼠血液中铜含量显著低于模型组(P<0.05)，而与对照组相比差异不显著(P>0.05)，说明五苓散对大鼠体内铜排泄有显著作用。另外，模型组大鼠血液中铜含量在试验结束时也比造模结束时有所降低，是大鼠正常代谢的结果。

表2 五苓散治疗后各组大鼠血液中铜含量的变化

Table 2 The changes of Cu content in blood of rats in three groups after treatment μg·g-1

2.4 五苓散治疗后各组大鼠血清中SOD、AST、LDH活性的变化

由表3可知，与模型组相比，泊疗组大鼠血清中SOD活性显著升高(P<0.05)，AST和LDH活性显著降低(P<0.05)；而与对照组相比，SOD、AST和LDH活性均差异不显著(P>0.05)。

表3 五苓散治疗后各组大鼠血清中SOD、AST、LDH活性变化

Table 3 The Changes of SOD， AST and LDH activeties in rat serum after Wuling San treatment U·L-1

2.5 肝、肾组织学检查结果

通过HE染色观察肝脏和肾脏组织的病理变化，结果显示：对照组大鼠肝小叶、门静脉等结构完整，呈现正常肝组织结构(图1-A)；肾脏结构完整，无明显病理变化(图1-D)。模型组大鼠肝脏出现明显的脂肪变性，存在炎性细胞浸润及纤维增生，胞浆内有明显的蛋白质颗粒，核固缩显著，大部分肝小叶结构消失(图1-B)；肾脏细胞出现空泡样变性，部分细胞坏死、脱落，肾小管扩张，存在间质纤维化(图1-E)。治疗组大鼠肝脏存在轻微的脂肪变性，肝小叶结构完整(图1-C)；肾脏少量细胞坏死、脱落，结构完整(图1-F)。

3 讨论

3.1 铜在动物体内的代谢及对机体的损伤

研究表明，从消化道摄入的铜在动物体内的吸收部位主要是十二指肠和小肠近端，部分铜的吸收也可发生在小肠远端，一些通过胆汁排出的铜，经肝肠循环再回收利用进入血液后被运送到全身各处。铜被吸收后主要分布在肝脏、肾脏、脑、心脏、毛发中，而肝脏不仅是铜的贮库，也是铜代谢的重要器官[5]。过量的铜集聚在肝细胞核、线粒体及肝浆液中，损伤这些亚细胞结构，抑制多种酶的活性，使谷草转氨酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)、血浆精氨酸酶(ARG)及血浆胆红素含量升高，导致肝功能障碍；当肝脏进一步受到损伤，铜就会被大量释放入血，使血铜含量升高。血铜进入红细胞，可使红细胞脆性增加而发生血管内溶血，继而导致贫血和血红蛋白尿、红细胞形态变化异常等。出现溶血时，肾铜浓度升高，肾小管被血红蛋白阻塞，从而引起肾单位坏死、肾功能衰竭、血红蛋白尿，甚至尿毒症，严重者骨骼肌、中枢神经系统损伤[6]。本试验结果显示，模型组大鼠形体消瘦、被毛焦燥、颜色发黄；肝质脆、发黄、肿胀明显，肾脏肿胀、呈巧克力色；SOD活性较对照组为低，AST、LDH则活性显著升高。五苓散治疗组大鼠肝脏略黄、肿胀不明显，肾脏稍软、略肿或不肿； SOD活性较对照组、模型组显著上升，AST、LDH活性则显著低于模型组，与对照组差异均不显著。说明五苓散能有效缓解铜中毒引起的肝、肾损伤，对体内蓄积的铜有较好的排泄作用。

A、B、C，分别为对照组、模型组、五苓散治疗组肝脏组织(HE染色，×40)；D、E、F，分别为对照组、模型组、五苓散治疗组肾脏组织(HE染色，×200)A， B， C were live tissues in control group， model group and treatment group， respectively; D， E， F were kindney tissues in control group， model group and treatment group，respectively (HE ×200)图1 大鼠肝脏和肾脏组织的病理学变化Fig.1 Pathological changes of liver and kidney tissues in rats

3.2 五苓散排铜的理论依据

中医认为，铜中毒属铜毒内蕴、湿热火毒内扰之证。铜浊毒邪蓄积于肝肾，造成肝肾气滞血结，脉络壅塞，正气耗伤，痰瘀留滞，水湿不化而成鼓胀[7]。源于东汉末年名医张仲景《伤寒杂病论》的五苓散，为太阳病表里双解法代表方之一，其组成为茯苓、泽泻、猪苓、桂枝、白术(炒)，具有温阳化气、利湿行水之功效，可治疗机体气化不利、水饮内停等证；其在外可解表，在内健脾化气利水，使人之水液代谢重归平衡[8]。现代药理学研究表明，五苓散能利水利尿、保护肾肝[9-10]，可用于肾小球肾炎、肝硬化腹水、急慢性肾炎等见水肿、少尿者[11]。由此看来，五苓散对应的主证与铜中毒病机相吻合。

3.3 五苓散各组成药味(茯苓、泽泻、猪苓、桂枝、白术)的利尿保肝作用

茯苓，具有化湿利水、通调下焦水道的作用，其中的茯苓素因拮抗醛固酮而产生利尿作用，而茯苓多糖则能增强机体免疫力、保肝、促进造血等[12-13]；泽泻，通小便、泄膀胱热、调节机体水液代谢等作用显著，其中的三萜类成分和泽泻醇等有效成分不但具有利尿作用，而且还能有效改善肝功能[14]；猪苓，专功利水，可入下焦消除肿满，与茯苓、泽泻配伍时还能加强利水袪湿作用，其中的麦角甾醇及VB等有利尿作用，还能清除自由基、治疗肝炎[15-16]；桂枝，具有温通经脉，助阳化气等功效，可辅肺脏行水、使膀胱通畅，其中的挥发油能通过促进SOD活性来抵抗脂质过氧化对机体的损伤[17]；白术，益气健脾、燥湿利水，其中的挥发性成分苍术酮通过抑制钠钾 ATP酶的活性发挥利尿作用，白术内酯则通过改善氧化应激造成的损伤以及调节炎性因子的水平来改善肾组织损伤，是白术中具有抑制炎症反应的活性成分[18-19]。可见，五苓散中的诸多有效成分是通过利尿作用来加速体内铜的排泄，通过抗炎、抗氧化来保肝护肾，从而修复铜在体内蓄积而造成的损伤。

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(责任编辑 卢福庄)

Effect of Wuling San on copper poisoning in experimental rats

CHENG Yan1， LIU Yayun1， ZHANG Fangjie1， HUANG Cuihua1， KANG Youxi1， HAN Chunyang1， CHEN Dingding2，*， LIU Cuiyan1，*

(1.CollegeofAnimalScienceandTechnology，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China; 2.BiotechnologyCenter，AnhuiAgriculturalUniversity，Hefei230036，China)

In order to investigate the effects of Wuling San， a Chinese herbal medicine compound powder with promoting diuresis， on the copper excretion in animal， the pathological model of subchronic copper poisoning in SD rats was established by feeding high copper diet， and then Wuling San as a therapeutic drug was given by means of intragastric administration to rats. After the success of building models and at the end of treatment， the blood sample of rats was collected by cardiac puncture for determining copper content with the method of flame atomic absorption spectrometry， and the activities of serum AST， LDH and SOD were detected by reagent kit. At the end of the experiment， all the rats were anatomized to observe the changes of pathologic autopsy of the internal organs， and the histopathologic changes of liver and kidney. Results showed that compared with control group， the rats of the model group were slow in velocity of body weight increasement， the obvious pathological changes of liver and kidney structure were found and the level of blood copper was significantly higher (P<0.01)， indicating that the model of subchronic copper poisoning in rats was successfully established. After treated with Wuling San， compared with model group， the treatment group had less detectable changes in histopathology， the level of blood copper was significantly lower (P<0.05)， SOD activity increased (P<0.05) and AST and LDH activities declined (P<0.05). The above five indexes had no significant differences between the treatment group and the control group (P<0.05). The results of this study indicated that Wuling San could effectively promote the excretion of copper in rats， alleviate the damage of liver and kidney， so it could be used to treat clinical subchronic copper poisoning of animals.

Wuling San; rat; copper poisoning; therapy

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.02.05

2016-09-09

国家自然科学基金资助项目(31172358)；2015年国家级大学生创新训练项目(201510364008)

程颜(1995—)，女，安徽宣城人，本科生，动物医学专业。E-mail: 410150915@qq.com

*通信作者，陈玎玎，E-mail: dingding0626@126.com；刘翠艳，E-mail:cyliu@ahau.edu.cn

S853.91

A

1004-1524(2017)02-0206-07