丙泊酚对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖/凋亡的影响及其分子机制

王 鹏，郝 伟，张 颖，任立洁，张艳莉，单世民

实验研究

丙泊酚对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖/凋亡的影响及其分子机制

王 鹏，郝 伟，张 颖，任立洁，张艳莉，单世民

目的：研究丙泊酚对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖和凋亡的影响及其相关分子机制。方法：将原代大鼠肺动脉平滑肌细胞接种在培养孔板，并随机分为对照组（C组）、丙泊酚2 μg/mL组（F1组）、丙泊酚5 μg/mL组（F2组），处理时间为24、48、72 h，收集对应细胞进行细胞增殖、周期和凋亡的检测，并收集对应的RNA和蛋白，利用荧光定量PCR和免疫印迹Western Blot检测细胞增殖/凋亡标志物PCNA、Bax的表达。结果：丙泊酚对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的抑制率及凋亡的促进率具有时间和浓度依赖性；MTT实验证明，5 μg/mL组的丙泊酚可显著抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖，同时抑制PCNA的mRNA和蛋白表达（二者下降比率为40%）；流式细胞术证实，5 μg/mL丙泊酚可诱导大鼠肺动脉平滑肌细胞的周期抑制和凋亡，并上调促凋亡蛋白BAX表达（上调比率为3.6倍）。结论：5 μg/mL浓度的丙泊酚在体外可有效抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖并诱导细胞凋亡。

丙泊酚；肺动脉平滑肌细胞；增殖；凋亡

丙泊酚具有抑制多种肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用[1-2]。以丙泊酚处理结肠癌细胞和乳腺癌细胞，可明显抑制其侵袭能力[3-4]。丙泊酚对肿瘤细胞生物学行为的影响及分子机制尚不明确，其对正常细胞特别是对肺动脉平滑肌细胞的影响鲜有报道。作为常用的静脉镇静催眠剂之一，长期、高剂量使用丙泊酚是否也会对正常肺动脉平滑肌细胞造成损害，目前研究尚不清楚。本研究探讨不同剂量丙泊酚对平滑肌细胞增殖和凋亡的影响，以期为临床用药提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 大鼠肺动脉平滑肌细胞制备 大鼠肺动脉平滑肌细胞（primary rat pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）采用胰蛋白酶消化后经联合组织贴块培养，最终使用免疫细胞化学和免疫荧光染色对细胞进行鉴定。具体操作按照文献方法[5]。

1.2 试剂 丙泊酚购自Sigma-Aldrich公司，产品编号D126608。MTT购自Sigma-Aldrich公司，产品编号M2128。Bax、PCNA和actin抗体购自Cell Signaling Technology公司。

1.3 MTT细胞增殖检测 大鼠肺动脉平滑肌细胞以每孔2000个细胞铺种在96孔板中，待细胞贴壁后分3组处理：对照组（C组），丙泊酚2 μg/mL组（F1组）和丙泊酚5 μg/mL组（F2组）。分别在24 h、48 h和72 h在每孔加入浓度为0.5λ的MTT各10 μL。将细胞置于37℃培养箱保温3 h，用真空泵吸出培养基，再加入100 μL DMSO溶解沉淀，摇床均匀摇晃板子0.5 h，OD570检测吸光度。作图并进行统计学检验。

1.4 细胞周期凋亡检测 用不同浓度丙泊酚处理过的大鼠肺动脉细胞经过消化离心，用300 μL预冷的PBS重悬于5 mL离心管中，在漩涡振荡器上低速以5 s一滴的速度缓慢滴入共700 μL提前预冷的无水乙醇，-20℃放置过夜。经过PI和RNaseI混合染料在37℃水浴染色1 h，在通过流式细胞仪进行细胞周期和中晚期凋亡检测。实验共重复3次，分别用ModFit和Flowjo软件对流式结果进行分析、作图。

1.5 RNA提取和实时荧光定量PCR 对用不同浓度丙泊酚处理过的大鼠肺动脉细胞，分别加入Trizol裂解液提取总RNA并保存于-80℃冰箱。利用Promega公司的总RNA反转录试剂盒进行反转录合成cDNA。实时荧光定量PCR在ABI公司的ABI 7500系统上进行，定量检测PCNA的mRNA表达情况，actin被用作内参基因，所用引物均合成自华大基因公司。

1.6 蛋白印迹检测 对用不同浓度丙泊酚处理过的大鼠肺动脉细胞，经过碧云天公司的RIPA裂解液裂解，提取细胞总蛋白。各样品经过定量，分别取60 μg进行SDS-PAGE。经过硝酸纤维素膜转膜，再用5%BSA屏蔽非特异性结合，依次孵育一抗及二抗，用ECL显色液显影检测细胞中BAX的蛋白表达。同样以actin作为内参。

1.7 统计学处理 本研究中用到的统计学检验均由SAS软件v9.2完成。所有数据均以()表示，两组数据间的比较采用成组t检验，P＜0.05认为有统计学差异。对细胞周期和细胞凋亡的结果进行了重复测量方差分析。

2 结果

2.1 MTT法检测丙泊酚对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响 C组与F1、F2组比较，细胞增殖较为活跃。F1组与C组比较，增殖在72 h时受到一定程度的降低，但未有统计学差异。在较高剂量的F2组中，48及72 h时间点下细胞增殖速度较C组显著下降（P＜0.05）图1。流式细胞术显示，丙泊酚处理72 h后，三组细胞周期分布存在统计学差异（P＜0.05），表1。提示高剂量的丙泊酚长期作用于大鼠肺动脉平滑肌细胞后，可抑制其正常增殖活性和周期进程，对增殖的抑制率具有时间和浓度依赖性。

图1 丙泊酚对大鼠肺动脉平滑肌细胞增殖的影响

表1 丙泊酚对大鼠肺动脉平滑肌细胞周期的影响

2.2 流式细胞术测定丙泊酚对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响 低剂量（2 μg/mL）丙泊酚处理48 h，可使细胞凋亡增加12%。以高剂量（5 μg/mL）丙泊酚处理48 h，细胞凋亡比例较C组增加31%（P＜0.05），表2。高剂量丙泊酚对于正常肺动脉平滑肌细胞具有损伤作用。

表2 丙泊酚对大鼠肺动脉平滑肌细胞凋亡的影响

2.3 不同剂量丙泊酚处理对增殖和凋亡标志物PCNA、Bax的调节 荧光定量PCR的结果显示，与C组比较，F1、F2组细胞中增殖标志物PCNA的mRNA表达随丙泊酚浓度增加而下降，其中F1组较C组差异不显著(P＞0.05)，F2组较F1及C组具有显著性差异(P＜0.05)，即高剂量的丙泊酚处理可下调PCNA的mRNA表达（图2A）。免疫印迹Western blot实验证实，在F2组细胞中观察到PCNA蛋白显著下降和Bax蛋白的显著上调，从蛋白层面支持凋亡发生（图2B）。

图2 不同剂量丙泊酚处理对大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖凋亡标志物PCNA、Bax的影响

3 讨论

丙泊酚是临床常用的静脉镇静催眠剂，同时广泛应用于各种手术的麻醉诱导。有效成分是2,6-二异丙酚，水溶性较差，市售丙泊酚一般为脂溶剂。新近的实验数据表明，丙泊酚具有抗肿瘤作用，包括直接或间接抑制细胞增殖和生存能力、诱导细胞凋亡及抑制侵袭迁移[6-7]。有报道显示，5 μg/mL丙泊酚处理肝癌细胞系HepG2后，该细胞的克隆形成率和愈合率显著下降，凋亡率显著上升[8-9]。在肺癌细胞HCC827细胞中，低剂量的丙泊酚（1.5 μL/mL）处理可抑制细胞增殖并诱导凋亡，且这一过程与细胞内Nrf2的激活表达有关[10]。以丙泊酚处理结肠癌细胞LOVO可抑制其侵袭能力[11]，也有人报道34 μmol/L丙泊酚处理可增强乳腺癌细胞MDA-MB-468的侵袭[12]。丙泊酚对肿瘤细胞生物学行为的影响及分子机制尚不明确，其对正常细胞特别是对肺动脉平滑肌细胞的影响更无研究。

目前，大部分研究认为，采用丙泊酚作为手术麻醉药物，一方面可发挥重要的麻醉作用达到手术的目的，另一方面根据体外的研究结果推测，丙泊酚可能对肿瘤患者的肿瘤细胞增殖和凋亡有良好的调节作用[13-15]。然而，由于丙泊酚对肿瘤细胞表型及功能影响的分子机制未明，其对正常体细胞是否也具有杀伤作用也值得关注。

本研究以大鼠肺动脉平滑肌细胞为研究对象，研究了高、低剂量的丙泊酚处理后，其对正常肺动脉平滑肌细胞的增殖能力和凋亡的影响。结果证实，在增殖方面，以高剂量的丙泊酚处理时间长达48～72 h时会显著抑制细胞增殖，这一抑制作用与细胞内PCNA的mRNA和蛋白下调表达具有相关性。在周期和凋亡方面，高浓度的丙泊酚处理48 h时可诱导较多的细胞周期抑制和细胞凋亡，这一促进凋亡作用与细胞内Bax蛋白水平升高有关。由于实验设计的局限性，本研究未能得到丙泊酚处理对大鼠肺动脉平滑肌细胞的在体效果，药物处理浓度和时间与临床使用习惯是否一致也不清楚，同时其抑制增殖和诱导凋亡的机制尚存有许多未知途径，需要后续工作继续探索和挖掘。

本研究通过体外实验证实，高剂量的丙泊酚可有效抑制大鼠肺动脉平滑肌细胞的增殖并诱导细胞凋亡，这一作用的发挥与细胞内下调表达的PCNA与上调的Bax蛋白相关。提示其作为手术麻醉药物，在高剂量长时间处理下对正常细胞具有一定的损伤作用。

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（收稿：2016-05-10 修回：2016-12-20）

（责任编辑 李文硕 屈振亮）

Study of Propofol on Growth and Apoptosis of Rat Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells and the Re-lated Mechanisms

WANG Peng,HAO Wei,ZHANG Ying,et al.Department of Anesthesiology,Tianjin 5th Center Hospital,Tianjin(300450),China

ObjectiveTo study the effects and related molecular mechanisms of propofol on growth and apoptosis of rat pulmonary artery smooth muscle cells.MethodsRat pulmonary artery smooth muscle cells were seeded in culture plates and treated with propofol(0,2,4～5 μg/mL)for 24 and 48 hours.Then,cells were harvested for measuring cell growth,cell cycle and apoptosis rates.RNA and protein were also extracted for real-time PCR and western blotting analysis of PCNA and BAX expression,respectively.ResultsPropofol could significantly induce growth inhibition and apoptosis in rat pulmonary artery smooth muscle cells at a concentration-and time-dependent manner.MTT assay showed that 5 μg/mL propofol could suppress growth of rate pulmonary artery smooth muscle cells,and reduce the mRNA and protein expression of PCNA(both at an approximate 40%reduction rate).Also,flow cytometry showed that propofol at high dose could induce cell cycle arrest,elevate the apoptosis rate of pulmonary artery smooth muscle cells,and meanwhile up-regulate the BAX protein expression in the treated groups(at an approximate 3.6-fold up-regulation).ConclusionPropofol at 5 μg/mL could suppress growth and promote apoptosis of rat pulmonary artery smooth muscle cells in vitro.

Propofol;pulmonary artery smooth muscle cells;growth;apoptosis

Q95-33；R971+.3

A

1007-6948(2017)01-0057-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.01.016

天津市卫生局科技基金项目（2014ZK016）天津市第五中心医院麻醉科（天津 300450）

单世民，E-mail：wangpang776@163.com