血瘀证大肠癌与外周血多药耐药基因mRNA表达的相关性

周忠波

血瘀证大肠癌与外周血多药耐药基因mRNA表达的相关性

周忠波

目的：探讨血瘀证大肠癌与外周血多药耐药基因（MDR-1）mRNA表达的相关性。方法：运用“证素辨证”的方法，对65例初诊大肠癌患者进行证素辨证，同时应用实时荧光定量PCR法检测其外周血MDR-1基因mRNA表达情况，探讨血瘀证大肠癌与外周血MDR-1基因mRNA表达的关系。结果：65例中，血瘀组42例（64.6%），非血瘀组23例（35.4%）；血瘀组与非血瘀组大肠癌病理分化程度存在统计学差异（P＜0.05）。与非血瘀组比较，血瘀组高分化比例较低，而低分化比例较高。血瘀组与非血瘀组临床病理分期差异具有统计学意义（P＜0.05）；血瘀组Ⅲ、Ⅳ期人数比例明显高于非血瘀组（P＜0.05）。血瘀组外周血中MDR-1的相对表达量均数为0.872±0.257，明显高于非血瘀组的（0.436±0.124）(P＜0.05)。结论：血瘀证大肠癌与外周血MDR-1基因mRNA的表达水平存在相关性。

大肠癌；多药耐药基因；实时荧光定量PCR；血瘀证

我国结肠癌、直肠癌发病率分别为12.69/(10万)、11.72/(10万)，居恶性肿瘤发病率第5、6位[1]。血瘀证是各种肿瘤常见的临床证候，肿瘤患者血液处于浓、黏、聚、凝的“高凝状态”[2]，并贯穿于肿瘤的发生、增殖、浸润和转移不同的病理阶段。大部分大肠癌对化学治疗的敏感性较差，肿瘤细胞对化疗药物产生多药耐药(multidrug resistance,MDR)是化疗失败最常见而又难以解决的问题之一[3-4]。活血化瘀类中药不仅在肿瘤的治疗中得到了广泛的应用，而且还具有逆转肿瘤多药耐药的作用。血瘀证与大肠癌多药耐药之间相关性如何，目前尚缺少这方面的临床研究。2013年1月—2015年7月，我们对65例大肠癌患者进行分析，以探讨血瘀证大肠癌与外周血MDR-1基因mRNA表达的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本组共65例，多以便血、大便次数增多、腹痛、不完全性肠梗阻等症状来诊，均经结肠镜取病理行病理学检查确诊（腺癌55例，其他类型10例）。男39例，女26例；年龄30～82岁，中位年龄（54.37±11.25）岁。腺癌中病理高分化11例，中分化32例，低分化12例。临床分期I期8例，II期14例，III期28例，IV期15例。根据血瘀证素的诊断阈值，进一步分为血瘀组（42例）与非血瘀组（23例）。

1.2 中医证素诊断标准 参照文献[5]、[6]对症状轻、中、重程度的定义，制定规范的四诊资料采集量表。在四诊基础上，按证素辨证方法进行辨证，采用国家标准术语，以各症状要素积分和阈值法确定证候及血瘀证素的权重。血瘀证素的诊断的确定以100作为通用阈值，各症状对各辨证要素贡献度之和达到或超100即可诊断。每一症状的轻重以中等程度为准，若该症状重，其定量诊断值乘1.5；若该症状轻，乘0.7。

1.3 标本采集 于病理诊断明确之后，空腹采集静脉血2 mL，肝素抗凝，分离得到白细胞后放入1.5 mL Ep管中，加入Trizol l mL。

1.4 总RNA提取及纯度分析 使用Trizol RNA提取试剂盒，按照说明书提取白细胞总RNA，用1%琼脂糖电泳检测所提取RNA的完整性，并用蛋白核酸测定仪DU800测定A260/A280比值在1.9～2.1之间。

1.5 引物合成 从GENEBANK上查找MDR-1基因碱基序列，应用primerex-press2.0软件设计引物，并由大连宝生物公司合成。引物序列见表1。

表1 目的基因及管家基因的引物序列

1.6 逆转录 按逆转录试剂盒（TaKaRa Code DDRR037A）操作说明进行逆转录。反应体系：Rnase Free dH2O 3 μL，Olig dT Primer（50 μM）1 μL，Random 6 mers（100 μM）1 μL，5×PrimeScript Buffer 4 μL，PrimeScript RT Enzyme Mix 1 μL，100 ng/μL Total RNA 10 μL，共20 μL，所得cDNA于-20℃保存。

1.7 实时荧光定量PCR 应用SYBR Green II荧光嵌合法。反应体系：SYBR PremixEx Taq II（2×）（TaKa-Ra Code DRR081A）12.5 μ L，PCR Forward Primer（10 μM）1 μL，PCR Reverse Primer（10 μM）1 μL，Rnase Free dH2O 8.5 μL，cDNA 2 μL，共25 μL。在Thermal Cycler Dice Real Time System TP800 3.00D系统进行，以β-actin为内参基因，应用双标曲线法求出各样品MDR-1基因的相对表达量。

1.8 统计学方法 使用统计软件SPSS 13.0，计量资料以均值±标准差()表示，组间差异采用t检验，计数资料采用χ2检验，以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 血瘀组与非血瘀组间外周血MDR-1基因表达水平比较 应用双标曲线法根据样品的Ct值分别得到目的基因和管家基因的初始模板量。经管家基因的均一化处理，分别得到MDR-1基因的相对含量，见表2。大肠癌血瘀组外周血中MDR-1相对表达量低于血瘀组(P＜0.05)。

表2 血瘀组与非血瘀组间外周血MDR-1基因的表达水平的比较（）

表2 血瘀组与非血瘀组间外周血MDR-1基因的表达水平的比较（）

注：与非血瘀组比较，aP＜0.05

组别血瘀组非血瘀组n 42 23 MDR-1 0.872±0.257a0.436±0.124

2.2 血瘀证与病理分化程度、临床分期的关系 血瘀组与非血瘀组高、中、低分化腺癌的总体构成比不同，χ2=6.457，P＜0.05，存在统计学差异。与非血瘀组比较，血瘀组高分化比例较低（P＜0.05），而低分化比例较高（P＜0.05），见表3。

表3 血瘀组与非血瘀组腺癌病理分化程度比较（n，%）

从分期情况看，经卡方检验，血瘀组与非血瘀组临床分期总体构成比不同，χ2=11.308，P＜0.05；血瘀组Ⅲ、Ⅳ期人数比例明显高于非血瘀组（P＜0.05），见表4。

3 讨论

血瘀证是包括大肠癌在内的各种肿瘤最常见的一种临床证候。祖国医学常把肿瘤归属于中医的“瘕积聚”、“瘕病”、“虚劳”等范畴,认为其发生多由情志郁结、饮食所伤，寒邪外袭以及病后体虚等以致肝脾受损、脏腑失和、气机阻滞、瘀血内停或兼痰湿凝滞而成积聚。究其病机，主要是气滞而导致血瘀内停，故“血瘀证”为肿瘤的一个基本证型。《黄帝内经》已论及肿瘤与血瘀证的关系,其后历代医家对血瘀与肿瘤的密切关系也都有所认识。现代多数临床和实验研究也证实，肿瘤与血瘀密切相关[7]。有研究表明，几乎所有癌症患者的局部或全身均存在高凝状态[8]。肿瘤患者血液处于浓、黏、聚、凝的“高凝状态”,被证实为肿瘤血瘀证,并贯穿于肿瘤的发生、增殖、浸润和转移不同的病理阶段[9-10]。贾小强等[11]研究发现，血瘀证大肠癌与病理类型、肿瘤浸润深度、侵犯周径、病理分期、转移情况等存在相关性，黄健飞等[12]的研究发现，热毒血瘀证与乳腺癌的肺转移呈正相关。

表4 血瘀证与临床病理分期的关系（n，%）

肿瘤的耐药性是肿瘤化疗失败的主要原因之一。多数人体肿瘤组织内存在MDR基因[13]，大肠癌存在MDR基因高表达[14-15]，其化疗过程中的耐药问题十分突出。MDR指由一种药物诱发，而同时对其他多种结构和作用机制完全不同的抗癌药产生交叉耐药的一种现象。肿瘤产生耐药有多种因素，如非典型的MDR、MDR-1基因及其编码产物P-gp糖蛋白的过度表达、肺耐药相关基因及肺耐药相关蛋白表达增加、MDR相关蛋白基因表达增高等。其中最重要的是MDR-1基因的过度表达及其编码产物P-糖蛋白的增多[16]。近年来，关于肿瘤的MDR机制及逆转剂的研究成为当前肿瘤化疗的研究热点，但化学逆转剂往往只针对其中的一种机制，而难以达到理想的治疗效果。中药具有多组分、多靶点、多阶段性作用特点，可以针对肿瘤MDR的多种机制进行有效的逆转。活血化瘀法是临床治疗肿瘤常用的治法，活血化瘀类中药在逆转肿瘤MDR方面的研究也颇多。因此，探讨血瘀证大肠癌与外周血MDR-1基因表达的关系，不仅可以为血瘀证大肠癌辨证提供客观指标，也可以为中药逆转肿瘤MDR方面的研究提供依据。

本研究结果表明，65例大肠癌患者血瘀组42例（64.6%），非血瘀组23例（35.4%）。血瘀证与病理分化程度、临床分期存在一定的相关性。血淤组与非血淤组大肠癌病理分化程度存在统计学差异，与非血瘀组比较血瘀组高分化比例较低，而低分化比例较高。从分期情况看，血淤组与非血淤组临床病理分期差异具有统计学意义，血瘀组Ⅲ、Ⅳ期人数比例明显高于非血瘀组。这与贾小强等[11]的研究结果一致。大肠癌血瘀组外周血中MDR-1的相对表达量均数为0.872±0.257，明显高于非血瘀组的0.436± 0.124，差异有统计学意义(P＜0.05)。提示我们，血瘀型大肠癌患者存在MDR-1高表达，在临床上选择化疗方案时应避开MDR药物外，还可以使用MDR拮抗剂。这也说明，为什么多种活血化瘀类中药具有逆转肿瘤MDR的功能。本文只是研究了MDR-1表达水平与血瘀证的关系，但肿瘤细胞的耐药机制是十分复杂的，临床表现为耐药时，既可能是一种耐药机制起作用，又可能是多种耐药机制共同作用的结果。因此，在以后的研究中应联合检测多个MDR指标，综合探讨与中医证型的关系，才能更好地指导临床研究，发现更加有效的逆转肿瘤MDR中药种类。

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（收稿：2016-05-20 修回：2016-11-22）

（责任编辑 周振理）

Relevance in Blood Stasis Syndrome of Colorectal Cancer and Expression of Multidrug Resistance-1gene mRNA in Peripheral Blood

ZHOU Zhong-bo Department of Anus&Colorectal Surgery,Maternal and Child Health Hospital of Linzi District,Zibo City（255400）,China

ObjectiveTo exploring the relationship between expression of multidrug resistance-1(MDR-1) and blood stasis syndrome of colorectal cancer.MethodsSixty-five patients with colorectal cancer were determined for different syndromes according to syndrome factor differentiation.MDR-1 mRNA were detected by Real-time fluorescent quantitative from peripheral blood of primary carcinoma of colon and rectum,and to detect its comparably correlation to blood stasis syndrome of colorectal cancer.ResultsThere were 42 patients in blood stasis group and 23 patients in non-blood stasis group,with statistical significance in differentiation of pathology between two groups（P＜0.05）.Compared with non-syndrome of blood stasis，there was a lower proportion of high differentiation adenocarcinoma and a higher proportion of low differentiation adenocarcinoma in syndrome of blood stasis（P＜0.05）,with clinical statistical significance between two groups(P＜0.05).The proportion of phase III,IV among syndrome of blood stasis was significantly higher than that among non-syndrome of blood stasis(P＜0.05).The average expression level of MDR-1 gene was 0.872±0.257 in syndrome of blood stasis and 0.436±0.124 in non-syndrome of blood stasis,showing significant differences between the two groups (P＜0.05).ConclusionExpression of MDR-1 in peripheral blood of patients with colorectal cancer shows association with blood stasis syndrome.

Colorectal carcinoma;multidrug resistance gene;real-time fluorescent quantitative PCR;syndrome of blood stasis

R735.3+4

A

1007-6948(2017)01-0007-04

10.3969/j.issn.1007-6948.2017.01.002

山东省淄博市临淄区妇幼保健院肛肠科（淄博 255400）

周忠波,E-mail：973588978@qq.com