血清TTR的表达与结直肠癌转移的相关性研究

徐静　张洪柱　徐玉芬

[摘要] 目的 研究分析结直肠癌转移与血清转甲状腺素蛋白（TTR）表达之间的相关性。 方法 选择2014年1月～2015年12月间我院收治的23例结直肠癌患者进行本次研究，采集其血液样本。根据是否出现了远处转移进行分组，将其中无远处转移的样本设为对照组，共11例；发生远处转移的样本设为观察组，共12例。所有样本都采用蛋白免疫印迹方法对TTR 表达进行半定量分析。 结果 通过计算两组样本的光密度比值，结果显示无远处转移的结直肠癌患者血清样本（对照组）中TTR的表达量更高，显著高于发生远处转移患者（观察组）血清TTR表达量，差异有统计学意义（P=0.023<0.05）。 结论 结直肠癌患者血清TTR的表达水平与肿瘤是否发生转移有相关性，发生远处转移结直肠癌患者血清TTR表达量显著更低，在今后对结直肠癌浸润与转移水平的评估中，TTR可作为一种肿瘤标志物。

[关键词] 血清TTR；结直肠癌；相关性；表达水平

[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-9701（2016）30-0016-04

转甲状腺素蛋白（TTR），也被称为“前白蛋白”，英文简称PA，是由4个相同亚基共同构成的一种四聚体，每个亚基由127个氨基酸组成，其主要功能是以转运蛋白的身份参与转运甲状腺素、视黄醇，同时TTR还能够体现体内蛋白的合成情况，当体内蛋白丢失，出现应激状态时，TTR水平会迅速下降，反之则增高[1]。由于TTR是一种甲状腺素与视黄醇的转运蛋白，所以其表达情况可体现机体的营养及某些病理改变，可作为预测疾病、判断疾病预后的一项指标[2]。为此，我院选取2014年1月～2015年12月间所收治的结直肠癌住院患者进行研究，分析发生远处转移与未发生远处转移患者TTR的表达情况，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入我院2014年1月～2015年12月结直肠癌住院患者23例为研究对象，所有患者均经病理确诊，经检查均未发现其他恶性肿瘤与甲状腺代谢疾病。采集血清样本，其中11例患者未出现远处转移，12例患者伴有远处转移（均属于肝或者胃转移），患者年龄最小48岁，最大79岁，平均（69.1±3.1）岁，其中男12例，女11例。全部患者于术前采集血清样本，术前均未进行放射治疗、化疗与免疫治疗，全部患者临床资料均齐全。血清样本均置于-80℃保存，采用全自动生化仪对血清蛋白浓度进行检测。

1.2方法

对23例患者血清采用蛋白免疫印迹半定量检测。①吸取30 μL血清标本，采用SDS-PAGE，变性温度设置为100℃，处理时间设置为18 min。②电泳浓缩胶电压设置为60 V，分离胶电压设置为120 V。90 min半干电转仪转膜，采用封闭液进行封闭，封闭液采用5%脱脂奶粉+PBST；封闭一抗，封闭液采用抗体稀释剂，TTR抗体：封闭液=1∶1000，β-actin抗体：封闭液=1∶400，在4℃下过夜；PBST：0.05% Tween+PBS，每20分钟对膜进行一次清洗，共清洗3次。封闭二抗，TTR抗体与β-actin抗体分别采用山羊抗兔（LgG H+L）辣根过氧化物酶抗体与山羊抗小鼠（LgG H+L）辣根过氧化物酶抗体，其中TTR抗体：封闭液=1∶1500，β-actin抗体：封闭液=1∶2000，将其放置在温室摇床孵育，时间设置为90 min，PBST每15分钟进行一次洗膜，共进行3次，采用DBA显色液对膜显色5 min[3]。然后采用分析软件Image J进行条带光密度的计算和分析。

1.3统计学处理

采用SPSS 21.0统计学软件对获得的计量资料、计数资料进行统计处理，伴有远处转移组与未发生远处转移组的计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，显著水平95%，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 有远处转移与无远处转移组患者血清TTR的表达结果比较

采集11例未发生远处转移的结直肠癌患者血清，实验以5或6例为一组，采用Western blotting杂交实验对血清中的TTR 进行测定，实验以β-actin 为内参，结果见图1。同样方法，运用杂交实验半定量分析12例发生远处转移结直肠癌患者血清中TTR表达，结果见图2。

2.2远处转移与无远处转移组结直肠癌患者血清TTR半定量结果比较

比较远处转移与无远处转移组结直肠癌患者血清TTR 与β-actin光密度值，β-actin 为参考标准，对比分析两类患者血清TTR的表达量相对变化，同时计算TTR 的变化相对比率。统计学分析显示，比较发生远处转移结直肠癌患者（观察组）与未出现远处转移结直肠癌患者（对照组）血清中TTR 的表达量，前者为（3.6±0.8），后者为（11.4±3.5），发生远处转移结直肠癌患者血清TTR表达量显著更低，二者差异有统计学意义（t=7.524，P=0.023<0.05）。

3 讨论

转甲状腺素蛋白（TTR）也被称为前白蛋白（PA），合成于肝脏与脉络丛，负责转运人体内甲状腺素、视黄醇蛋白并参与维生素A 的代谢。甲状腺结合前清蛋白，属于血浆运输蛋白，主要负责转运维生素A与蛋白和甲状腺素结合。甲状腺结合前清蛋白主要于肝脏、眼睛和脉络膜中产生，在人体血浆及脑脊髓液中有分布[4]。在pH=7.2的生理条件与环境下，TTR是一种稳定的蛋白质，其基本结构及其功能均是稳定的[5]。当TTR发生分解成为单体后，将会导致淀粉变性病[6]。与正常人血清中TTR表达量比较，恶性肿瘤患者血清中的TTR表达量往往体现为低表达。相关研究结果表明，与正常人相比，在肝癌、肺癌患者中TTR表达呈下降态势[7-8]，所以，在恶性肿瘤中TTR 基因具有抑癌基因的作用。通过查阅大量的文献资料，有关恶性肿瘤TTR表达的研究报道指出，在恶性肿瘤的发生与发展的过程中，TTR起到了肿瘤抑制物的作用，对肿瘤有抑制作用[9-10]。国外相关研究报道指出，通过对比结直肠癌患者与正常人的血清蛋白差异点，结果显示二者在TTR 的表达上存在显著的差异，但对比CEA阴性与阳性患者血清蛋白差异点，结果显示并无显著性差异[11-12]。在结直肠癌的诊断中，TTR可作为标志物，研究显示，血清蛋白优势更加明显。当前在恶性肿瘤的分期和分级中，有关TTR的报道较少，有关研究指出结直肠癌患者出现淋巴转移的与未出现淋巴转移的TTR表达量并没有显著差异[13-14]。上述研究结果显示，TTR基因具有抑制癌癥的作用，而结直肠癌的发展与TTR表达存在一定的联系，并且不同分期中TTR蛋白的表达存在明显的差异，预示着TTR的诊断价值。

本研究选择2014年1月～2015年12月我院所收治的结直肠癌患者作为研究对象，实验结果表明，对比没有出现远处转移结肠癌患者血清中的TTR表达，出现远处转移结直肠癌患者血清中TTR的表达呈明显下降态势，对比分析两类患者血清TTR的表达量相对变化，计算TTR 的变化相对比率。远处转移结直肠癌患者TTR 的变化相对比率为（3.6±0.8），与未出现远处转移结直肠癌患者TTR 的变化相对比率（11.4±3.5）比较显著更低，此结果提示对TTR表达水平的研究可作为一种重要的标志物来推断结直肠癌的发生与进展[15-17]。

TTR参与到甲状腺素、视黄醇的转运当中，目的在于保证体内甲状腺素、视黄醇以及结合蛋白水平处于正常水平[18]。TTR有很多种突变体，突变体的存在会造成多种疾病发生，其与细胞本身的变异、疾病的发生与发展紧密相关。现阶段大部分恶性肿瘤的治疗的关键就在于早期诊断，这对肿瘤研究起着巨大的作用。结合国内外相关研究，主张TTR检测可对多种恶性肿瘤进行预测，因此被认定是一种良好的标志物，用于恶性肿瘤的诊断具有很高的价值[19]。当前其他肿瘤相关研究并未提及恶性肿瘤在TTR基因结构上存在异常，用于体外转染癌细胞是否能够抑制其生长并无定论，且对TTR具体影响肿瘤的机制也尚待研究[20-21]。当前针对TTR与肿瘤发生、发展关系的研究样本数量并不多，结果也有待进一步的研究，通过对TTR及其突变体在肿瘤中的作用机制研究，可对该基因多态性病因学更好地做出阐述[22]。由于TTR存在部分突变体，当这些突变体发生变化时将可能对诊断的准确性造成一定的影响，造成结果不准确，这也是需要进一步探讨的问题。当前测定总体TTR含量可采用电流测定，同时酶联免疫法测定TTR技术也逐渐得到应用推广，测定技术变得更加成熟，而测定结果也更加稳定，特异性也显著提高，因此进一步开展对TTR表达的研究可使临床肿瘤测定结果稳定性和特异性也进一步提高，相信深入开展TTR 对于临床肿瘤的诊断具有非常重要的意义和发展前景。

综上所述，结直肠癌患者血清TTR的表达水平与肿瘤是否发生转移有相关性，发生远处转移结直肠癌患者血清TTR表达量显著更低，在今后对结直肠癌浸润与转移水平的评估中，TTR可作为一种肿瘤标志物。

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（收稿日期：2016-06-24）