狂犬疫苗的研究进展

李岩异，戴碧璇，谭丽霞，张彩乔，李宏进，张卫婷

华北制药金坦生物技术股份有限公司，石家庄 050010

狂犬疫苗的研究进展

李岩异，戴碧璇，谭丽霞，张彩乔，李宏进，张卫婷

华北制药金坦生物技术股份有限公司，石家庄 050010

全球每年由狂犬病毒引起的死亡人数为50 000例，狂犬病毒严重威胁着人类的健康。目前狂犬疫苗是抵御狂犬病毒的最有效的手段，随着近些年生物技术的不断发展，人类对新型疫苗的研制取得了显著的成果，安全有效的人用狂犬疫苗的出现，为人类抵御狂犬病毒提供了更有效的保护。细胞培养的狂犬疫苗还将是当前和未来一段时间人类抵御狂犬病毒主要手段，而单克隆狂犬病毒免疫球蛋白药物不久的上市，将为人类抵御狂犬病毒提供更安全有效的治疗。

狂犬病毒；狂犬疫苗；糖蛋白

1 狂犬病毒概述

狂犬病毒属于弹状病毒科、狂犬病毒属。狂犬病毒基因组中有一个核糖核酸链，其反义链编码5个蛋白分别是核蛋白、磷酸蛋白、基质蛋白、糖蛋白和RNA聚合酶。每年感染狂犬病毒导致超过50 000人死亡，而且大部分发生在亚洲。除了狂犬病毒，狂犬病毒包含一系列公认和判定的成员，这些病毒能够造成人的偶然死亡[1]。狂犬病毒是一种人畜共患的病毒，哺乳动物的食肉目和翼手目为主要宿主，家犬是作为人类疾病最重要的宿主来源。在美国，多种类的蝙蝠会引发狂犬病毒对人的传播，尤其是在美国洛杉矶常见的吸血蝙蝠和在北美的昆虫蝙蝠。这些情况的出现对公众的健康造成威胁[2]。

2 狂犬病的传播和治疗

狂犬病毒转移的发生起源于被感染的宿主的伤口，引起咬伤伤口处唾液病毒的沉积。狂犬病毒是一种高神经营养和高度可变的病毒，其发病期经常会持续数月，病毒感染周边神经进而上升到背根神经节。一旦感染到脊髓，病毒迅速扩散至大脑，引发致命性的脑炎，最终杀死宿主。采用组织病理学的方法检测感染的大脑后，结果显示，许多病例中会出现独特的包裹体和Negri小体。免疫标记结果显示，许多感染的神经元伴随着胶质细胞的增生[3]。这些改变主要是在后脑中被发现，一旦感染发展，而没有有效的治疗，具有接近100%的致死率，在所有的感染中显得非常独特。但是，在被咬伤暴露伤口之前或在伤口暴露后很短时间内给予疫苗的注射，当前的疫苗能非常有效的防止这种结果的发生。病毒中和抗体的产生对于抵制感染非常重要，狂犬病毒疫苗促进机体产生抗狂犬病毒抗体是有效的。但狂犬病发展到后期，狂犬病毒中和抗体是不起作用的，这可能是高致死率的一个重要的原因。虽然经过广泛的研究，但是对于该病毒没有有效的抗病毒的治疗方法[4-5]。

3 人用狂犬疫苗的发展

3.1 神经组织来源的疫苗

在1885年7月6日，巴斯德最早发明了有效的疫苗来治疗狂犬病毒，第一次采用疫苗来治疗被咬伤的人类患者。治疗方法是取被狂犬病毒侵染的兔子的脊髓浆液，经无菌的空气烘干后进行接种。最初接种者被皮下注射完全灭活的浆液。巴斯德的方法被证明是有效的，随后这种方法被广泛传播，但随之产生了两个问题。首先，如何保证灭活的一致性，因为在某些情况下，接种人由于接种疫苗发展为狂犬病。其次，如何从兔子身上产生疫苗以满足对狂犬病的治疗。从感染山羊和绵羊的脑部获得狂犬病毒，并通过化学试剂苯酚进行灭活，使得上述两个问题得以解决。这些来源的疫苗虽然证明是有效的，但是与巴斯德疫苗一样，含有高含量的髓鞘成分，这些成分能使一些疫苗接种者发生致敏反应，在极端的案例中会发生致命的脑炎[6]。

也在考虑替代品，包括感染鸡胚胎病毒的灭活，感染哺乳期老鼠脑部病毒的灭活，幼年期老鼠脑部的髓鞘含量比成年期老鼠脑部髓鞘要少。但是这些方法不能完全消除自身免疫性反应的发生。因此，虽然一些国家还在应用这些疫苗，但是世界卫生组织不提倡使用来源于神经组织的疫苗。

3.2 禽胚胎来源的疫苗

由于来源于神经组织的疫苗具有上述不良反应，1956年Peck[7]采用了鸭胚胎来制备疫苗，将狂犬病毒毒株接种至7日龄鸭胚卵黄囊，培养2周左右，将胚胎细胞磨碎，制成悬液后灭活。该疫苗在欧美国家被广泛使用了近30年，但鸭胚胎来源的疫苗存在免疫原性差、中和抗体水平低于神经来源的疫苗及不良反应发生率高的缺点。自20世纪80年代，发达国家不再生产和使用这种疫苗，但人类利用禽胚胎进行狂犬疫苗的研制没有停止，瑞士一家公司采用化学提取和区带离心技术，利用鸭胚胎成功生产了一种新型狂犬疫苗，该狂犬疫苗不良反应少、免疫效果好，已经上市多年。

3.3 细胞培养来源的疫苗

一种新的狂犬疫苗制备形式，即采用细胞培养的方法来培养狂犬病毒逐渐形成。第一个组织培养病毒来源的疫苗是将病毒在原发性地鼠肾细胞上培养，由该技术生产的疫苗于1968年获加拿大批准后使用。我国是在20世纪80年代用狂犬病病毒北京株生产疫苗；而日本等东南亚国家于20世纪80年代采用Flury HEP株适应原代鸡胚细胞，并广泛使用；荷兰采用原代狗肾细胞进行病毒株的培养，该疫苗在免疫方面也取得了不错的效果。

在满足狂犬疫苗规模化生产需求方面，传代细胞起着重要作用，传代细胞会附着在生物反应器中的微载体表面生长，同时可以通过胰蛋白酶进行消化，进行传代和转移，这种技术大大降低了生产成本。有代表性的传代细胞为VERO细胞，该细胞是一种不限代次无限繁殖且不致癌的细胞，已被WHO批准作为人类疫苗的生产基质。由VERO细胞培养的狂犬病毒病毒收液毒价高、价格低、免疫效果非常好。

目前公认最佳的狂犬疫苗是人二倍体细胞疫苗，该疫苗是由美国Wistar研究所首创，是用人肺细胞WI-38株适应和培养病毒。法国某研究所用MRC-5细胞生产狂犬疫苗，并取得很好的效果。据统计，人二倍体细胞疫苗是接种后不良反应最轻、免疫效果最好的疫苗[8]。

4 狂犬疫苗的发展趋势

4.1 重组疫苗

随着生物技术的不断进步，人类对基因工程的认识不断提高，出现了以活病毒为载体的疫苗和非复制病毒为载体的疫苗。

活病毒为载体的疫苗是将狂犬病病毒的G蛋白基因转入到病毒内而生产新型疫苗的方法。据报道，目前正在研究使用的活病毒有痘苗病毒、腺病毒等。由于该类方法生产的疫苗对临床安全性的影响，目前该类疫苗都用于动物的免疫。该类疫苗因含有狂犬病毒的G蛋白，不具有狂犬病毒的感染能力，免疫原性好，在动物中免疫效果较好，不良反应也少。1995年梅里埃公司将狂犬病毒糖蛋白重组痘苗病毒V-RG，生产疫苗Raboral，于1995年获得了美国农业部颁发的许可证。由于该疫苗同时含有其他病毒毒性，且属于基因工程病毒，不能应用于人类。

非复制病毒为载体的疫苗采用的病毒载体不能在宿主中进行复制传代，能够表达狂犬病毒的G蛋白，从而发生免疫应答。由于该技术生产的疫苗对于宿主机体具有高度的安全性，所以可以进行人用疫苗领域研究。目前主要的病毒载体为复制缺陷型痘病毒和复制缺陷型腺病毒。Cadoz等[9]采用金丝雀痘病毒为载体，将狂犬病毒株ERA的G基因插入其中，该重组病毒在哺乳动物细胞中是流产性复制，利用该研究成果生产的疫苗进行了Ⅰ期临床试验，结果表明，志愿者都能很好地耐受该疫苗，接种后只是在注射部位出现轻微不适，接种后均可诱导志愿者产生抗体，具有人类疫苗的潜力。

4.2 植物来源疫苗

植物在进行蛋白表达时，能够进行蛋白合成后的折叠、糖基化等后期修饰，同时植物的病原体对人类和动物不致病。所以，近些年来研究人员开始将狂犬病毒的G蛋白作为目的基因，重新插入重组植物病毒载体中感染植物，从而获得狂犬病毒疫苗。正在研究的植物来源狂犬病毒疫苗所采用的植物有马铃薯、苜蓿花、烟草等[10-11]。该技术是采用植物来生产抗原的，这为疫苗的研究和发展提供了一个新的策略。该技术离实际应用还有一定距离，但从现有的结果来看，这类疫苗的前景还是看好的。

4.3 DNA疫苗

DNA疫苗是将狂犬病毒的G蛋白的cDNA插入到质粒DNA中，从而制得疫苗。1995年科学家就开始尝试应用该技术生产疫苗，通过对小鼠的免疫实验发现，免疫后小鼠抗体增加，同时未发现明显的不良反应，用狂犬病毒攻击接种后的小鼠，该疫苗表现出良好的保护作用[12]。DNA疫苗在接种者体内能够持续产生抗体，同时DNA疫苗的生产周期短，对温度稳定性强，便于储运和大量制备，但诱导抗体产生时间长，所以DNA疫苗适用于动物和高危易感人群的预防。DNA疫苗面临的一个重要的问题就是安全性。DNA疫苗一旦接种后，就会长期存在于接种者体内，虽然能长期使机体获得免疫效果，但有可能会造成基因突变，引发机体癌变。所以，DNA疫苗未来在宠物中的应用相对较好，在人类中应用比较渺茫。

4.4 G蛋白亚单位疫苗、多肽疫苗与免疫复合物

4.4.1 亚单位疫苗

狂犬病毒中的G蛋白在免疫应答中起着重要免疫作用。目前亚单位疫苗分为3类：糖蛋白亚单位疫苗、核糖核酸蛋白亚单位疫苗（RNP）、重组核酸蛋白亚单位疫苗。

糖蛋白亚单位疫苗分为天然糖蛋白疫苗与重组糖蛋白疫苗。天然糖蛋白疫苗来源于自然状态下的狂犬病毒，通过采用TritonX-100处理，使糖蛋白从病毒膜表面分离下来，之后，糖蛋白直接免疫小鼠。小鼠的抗体表达量非常少，在配合佐剂制成疫苗后，接种者抗体表达会显著提高。重组糖蛋白疫苗是采用病毒为载体表达狂犬病毒的糖蛋白，但该糖蛋白在后期提纯方面存在困难，该疫苗未取得发展。

病毒复制时，核蛋白和狂犬病毒的RNA紧密结合，并将RNP包裹。RNP具有抗原性，但是无免疫反应性，不能诱发机体产生中和抗体，但其可以长期产生免疫保护反应。RNP还可以协同免疫反应，用RNP初次免疫小鼠后，再使用狂犬病毒疫苗进行免疫，诱生表达的中和抗体水平比未进行RNP初次免疫的要高。

重组核酸蛋白亚单位疫苗也具有与RNP相同的免疫效果，苏焱等[13]研究表明，RNP与重组核酸核蛋白的抗原性无差异。经重组核酸核蛋白初次免疫小鼠后，诱生表达的中和抗体水平要明显高于未经重组核酸核蛋白进行初次免疫的小鼠。

4.4.2 多肽疫苗

狂犬病毒多肽类疫苗分为化学裂解多肽、合成肽、基因工程肽、免疫复合物。化学裂解后，狂犬病毒糖蛋白的抗原表面还能诱导机体产生中和抗体，但由于片段发生断裂，所出现的免疫效果低于自然状态下完整的糖蛋白[14]。

根据狂犬病毒的核蛋白序列，Ertl化学合成了T细胞表位和B细胞表位结合位点的2条多肽，免疫小鼠后，能发挥与RNP相同的免疫效果，同样不能诱导中和抗体的产生。但根据狂犬病毒的糖蛋白序列合成的多肽，免疫小鼠后，能检测到中和抗体，但其滴度明显低于狂犬病毒诱导水平。

目前以植物为载体进行狂犬病毒的多肽表达得到的多肽比化学合成的多肽抗原性要好、制备方便、价格低廉，是制备狂犬病毒多肽更好的方式[15]。

4.4.3 免疫复合物

亚单位疫苗、多肽疫苗毒性低，但由于其分子小，免疫原性差，而免疫复合物能克服这个缺点。狂犬病毒的免疫复合物是将高度纯化的狂犬病毒糖蛋白分子嵌到脂质体的双层膜表面，模拟天然病毒的结构，免疫小鼠后，可以诱导中和抗体的产生。Morein等[16]研制的狂犬病毒糖蛋白免疫复合物（ISCOM），免疫小鼠和狗后，诱导表达的中和抗体较高，免疫效果与商品化的人用狂犬病二倍体细胞疫苗相近。

5 狂犬疫苗替代品的发展

5.1 狂犬病毒抗体

尽管当前的商品疫苗在抵抗狂犬病方面的成功是不容怀疑的，但是一直在尝试开发新的替代品。抗体在抵御狂犬病毒的传播方面已被证实起到关键的作用。抗体的重要目标是病毒的糖蛋白，而糖蛋白是病毒颗粒唯一暴露于表面的蛋白，很多与单克隆抗体结合的抗原表位能够被其识别。将狂犬病毒糖蛋白克隆至细菌质粒中，然后在不同系统中表达该蛋白，已经显示能够有效保护疫苗模式老鼠，抵御病毒。目前华北制药开发研制的国家一类新药重组人源抗狂犬病毒单克隆抗体（rhRIG），是我国第一个拥有自主知识产权的重组人源抗狂犬病毒抗体，正在进行Ⅱ期人体临床试验，结果良好。

5.2 反向遗传学

在狂犬病毒治疗领域中一直存在的挑战是如何治疗超过姑息治疗的患者。实验模型显示哺乳动物宿主脑部能够产生对狂犬病毒固有的免疫反应，但是有证据显示，这种免疫反应受到病毒磷蛋白的拮抗抑制。这种拮抗反应可能导致一旦狂犬病毒在中枢神经系统中繁殖，固有免疫和适应性免疫的失效，最终导致宿主的死亡。因此现在鼓励治疗性的狂犬病毒的方式，通过修饰狂犬病毒的基因组得到更强的毒株接种到宿主中，以减轻狂犬病毒的感染[17-18]。

6 狂犬疫苗未来展望

近几年，新型疫苗的研究取得了可喜的成果，从现有的研究进展看，这些疫苗都有望成为动物疫苗有效的替代品。但要想用于预防人类狂犬病，这些新型的疫苗与传统的细胞培养疫苗相比，还缺乏安全性和有效性证据。狂犬病治疗性单克隆抗体目前已获得了显著成果，有望在5年内上市，为狂犬病毒暴露后的治疗提供了重要的保护。另外，虽然对狂犬病毒感染后的治疗药物和疫苗越来越多，也已经取得了显著效果，但还是要从根本上控制人狂犬病的发病率。

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New progress and prospects of rabies vaccine

LI Yanyi，DAI Bixuan，TAN Lixia，ZHANG Caiqiao，LI Hongjin，ZHANG Weiting
North China Pharmaceutical Group Corporation Genetech Biotechnology Co., Ltd., Shijiazhuang 050010, China

Every year, the number of deaths caused by rabies virus is 50 000. Rabies virus is a serious threat to human health worldwide. The rabies vaccine is the most effective way against rabies virus in recent years. With the development of biotechnology, the new type of vaccines in humans has appear, which is safe and effective for human. Rabies vaccine prepared in cells would be the main method nowadays and in the near future, while monoclonal immunoglobulin drugs will soon provide a safer and more effective way against rabies virus.

rabies virus; rabies vaccine; glycoprotein

10.3969/j.issn.1674-0319.2017.01.016

李岩异，硕士研究生。研究方向：医药工程。E-mail：heroyanyi@163.com