运动预适应对急性运动性损伤后心肌组织解耦联蛋白2表达及氧化应激水平的影响

公雪，李晓燕

· 论著 ·

运动预适应对急性运动性损伤后心肌组织解耦联蛋白2表达及氧化应激水平的影响

公雪1，李晓燕1

目的观察运动预适应对急性运动损伤后大鼠心肌组织解耦联蛋白2表达及氧化应激水平的影响，探讨运动预适应对急性运动性心肌损伤的保护作用。方法将30只健康成年雄性Wistar大鼠随机分为3组（每组各10只）：安静对照组（C）、一次力竭运动组（E）、运动预适应+一次力竭组（EE）。通过一次性力竭游泳运动建立大鼠急性运动性损伤模型，EE组力竭运动前进行运动预适应训练，力竭运动时记录各组大鼠力竭时间，力竭运动后检测各组大鼠心肌线粒体内丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平；RT-PCR检测心肌组织解耦连蛋白2（UCP2）的mRNA水平，免疫组化法检测心肌组织UCP2蛋白表达。结果氧化应激水平：与C组比较，E、EE组心肌细胞线粒体SOD活性及GSH-Px活性均显著降低，SOD活性分别降低60.50%、28.64%（P均＜0.01），GSH-Px活性分别降低51.23%、39.12%（P均＜0.01），MDA浓度分别升高187.70%、155.66%（P均＜0.01）。与E组比较，EE组心肌细胞线粒体SOD活性分别升高80.65%，GSH-Px活性升高24.83%；MDA浓度降低11.14%（P均＜0.01）。UCP2表达水平：与C组比较，E组UCP2mRNA相对量及蛋白相对表达量均明显升高（P＜0.01）；与E组比较，EE组UCP2mRNA相对量及蛋白相对表达量均明显降低（P＜0.01）。结论急性运动性损伤使心肌组织UCP2表达增多，并可提高氧化应激水平，运动预适应可减少UCP2表达并减轻氧化应激水平，对心肌组织具有保护作用。

运动预适应；运动性心肌损伤；解耦联蛋白2；氧化应激

运动预适应（EP）是指机体反复的适度运动 刺激后，可使心肌在后续的持续性缺血中得到保护的现象，是防止心肌缺血再灌注损伤的重要保护措施。大强度剧烈的运动，也可导致心肌缺血，并造成急性心肌损伤，国内外已有研究[1,2]显示EP可有效减轻力竭运动后急性心肌损伤。另有研究[3]显示急性力竭运动可使心肌线粒体解耦联蛋白2（uncoupling protein 2，UCP2）表达减少，影响心肌能量代谢。UCP2是解耦联蛋白家族的一员，位于线粒体内膜上，可增加线粒体内膜对质子的通透性，降低线粒体内膜两侧的质子浓度差，使呼吸作用中的氧化与磷酸化作用解耦联，使能量以热能形式释放，造成能量代谢障碍。

本研究主要通过观察运动预适应对力竭运动后心肌的氧化应激UCP2表达的影响，观察运动预适应对力竭运动致心肌损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验试剂亚细胞结构线粒体提取试剂盒（武汉博士德）；BCA蛋白定量试剂盒（武汉博士德）；超氧化物歧化酶测试盒（南京建成生物）；丙二醛测试盒（南京建成生物）；谷胱甘肽过氧化物酶测试盒（南京建成生物）；总RNA提取试剂盒（日本TaKaRa）；反转录试剂盒（日本TaKaRa）；SYBR Green DNA扩增试剂盒（日本 TaKaRa）；兔抗大鼠UCP2多克隆抗体（武汉博士德）；免疫组化试剂盒（美国罗氏）；

1.2 实验动物分组与模型建立选用清洁级健康成年雄性Wistar大鼠30只（由山东大学齐鲁医院心血管研究中心动物房提供），12周龄，体重200 ±40g。大鼠分笼饲养，采用标准实验大鼠饲料喂养，纯净水自由饮用，自然光照，动物室内温度23±2℃，相对湿度为50±5%。适应性饲养6 d，每天进行15 min适应性游泳运动，6 d后随机分为3组，每组各10只，分别为安静对照组（C）、一次力竭运动组（E）、运动预适应+一次力竭组（EE）。

利用游泳运动建立急性运动性损伤模型，泳池体积100×70×80 cm，水深50 cm，水温（32± 3）℃，每次游泳运动均换用新水，且游泳运动结束后立即用吹风机将大鼠吹干。分组后，C组不进行游泳训练，2周后同其他组一起处死；E组平时不运动，2周后行游泳运动直至力竭，力竭后随即处死；EE组力竭运动前须行运动预适应训练，运动预适应训练方法参照Margonato等[4]建立运动预适应动物模型的方法（即游泳运动持续2周，6 d/周，运动60 min/d，在60 min的游泳运动中，游泳15 min，休息5 min，重复3次），运动预适应训练后同E组一起进行一次性力竭运动后立即处死。大鼠力竭标准根据Thomas力竭标准判定，即大鼠沉入水底超过10 s或游泳运动明显不协调，捞出后无逃避反应且无法完成翻正反射。各组处死后留取心肌组织，并取少量心尖部组织浸泡于4%多聚甲醛中固定，其余组织均立即放入液氮中冷冻保存。

1.3 记录各组大鼠力竭时间记录E组和EE组大鼠从下水到最后力竭所用时间，并进行比较。

1.4 心肌组织线粒体氧化指标检测检测各组心肌组织线粒体中SOD、MDA、GSH-PX含量。取100 mg心肌组织，用预冷的PBS冲洗漂去浮血，放入玻璃匀浆器在冰浴上将其匀浆，然后用差速离心法分离心肌线粒体，并得到线粒体蛋白，利用BCA蛋白质定量法测定各样本线粒体蛋白浓度。SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，MDA测定采用硫代巴比妥酸比色法，GSH-PX测定采用二硫代二硝基苯甲酸法比色法，试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，所有操作均按照说明书进行。

1.5 RT-PCR法检测心肌组织UCP2 mRNA表达采用Trizol法提取心肌组织总RNA，OD260/ OD280测试RNA纯度。根据cDNA反转录试剂盒操作说明进行反转录，以β-action为内参，SYBR Green法荧光定量分析各组目的基因表达情况，结果用2-△△t表示。所用PCR引物，UCP2：上游5-GGCGGTGGTCGGAGATAC-3，下游5-GAGGCAATGACGGTGGTG-3；内参β-action：上游5-TGGCACCCAGCACAATGAA-3，下游5-CT AAGTCATAGTCCGCCTAGAAGCA-3。退火温度为60℃，共40个循环，所有引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。

1.6 免疫组化法检测心肌组织UCP2蛋白表达石蜡切片常规脱蜡，PBS冲洗后置入3%过氧化氢甲醛溶液中，37℃封闭30 min，加0.1%胰蛋白酶，37℃抗原修复20 min，加羊血清37℃ 30 min，后加一抗体（浓度均为1:300），4℃过夜。37℃复温60 min，加二抗37℃ 30 min，加辣根酶标记的链霉卵白素工作液37℃ 30 min，DAB显色，苏木精复染，用中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗。采用IPP 6.0图像分析软件对×200倍光镜下的图像进行分析,每个样本选4个视野，求平均光密度（平均IOD）并取平均值表示目标蛋白的相对量表达量。平均IOD=总IOD/视野总面积。

1.7 统计学方法采用SPSS 19.0统计软件进行统计分析，计量值以平均数±标准差（s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One way ANOVE），进一步两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.01为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠力竭时间观察发现，EE组较E组力竭时间明显延长，E组力竭时间（5.2±0.4）h，EE组力竭时间（6.7±0.6）h，差异有统计学意义（P＜0.01）。

2.2 各组心肌细胞线粒体氧化应激指标检测结果结果显示，与C组比较，E、EE组心肌细胞线粒体SOD活性分别降低60.50%、28.64%（P均＜0.01），GSH-Px活性分别降低51.23%、39.12%（P均＜0.01），MDA浓度分别升高187.70%、155.66%（P均＜0.01）。与E组比较，EE组心肌细胞线粒体SOD活性升高80.65%，GSH-Px活性升高24.83%，MDA浓度降11.14%（P均＜0.01）（表1）。

表1 各组心肌细胞线粒体氧化应激指标结果比较（s）

表1 各组心肌细胞线粒体氧化应激指标结果比较（s）

注： 与C组比较，aP＜0.01；与E组比较，bP＜0.01，cP＜0.01

组别 n SOD（U/mg.pro）GSH-Px（U/mg.pro）C组 10 72.60±0.92 3.09±0.09 5046±16 E组 10 28.68±1.17a8.89±0.15a2461±23aEE组 10 51.81±1.30b7.90±0.14b3072±29bMDA（nmol/mg.pro）

2.3 RT-PCR检测各组心肌组织UCP2基因mRNA相对表达量根据RT-PCR结果显示，UCP2基因mRNA表达：E、EE组较C组表达升高，EE组较E组表达降低，差异有统计学意义（P均＜0.01）（图1）。

2.4 免疫组化法检测各组心肌组织UCP2蛋白相对量表达量如图2免疫组化结果显示，UCP2蛋白阳性产物均分布于细胞质的棕褐色颗粒，E组、EE组较C组阳性表达产物增多，EE组较E组阳性表达产物减少。IPP6.0图像分析软件分析各组平均IOD结果，C组、E组、EE组平均IOD分别为（0.277±0.091）；（0.640±0.122）；（0.438 ±0.106），各组比较差异有统计学意义（P均＜0.01）。

3 讨论

研究显示，急性大强度运动训练可造成心肌组织结构及功能损伤，其机制可能为氧化应激、细胞凋亡、钙离子超载及能量代谢障碍等[5-7]。另外研究发现EP具有提高心肌对缺血、缺氧的耐受力，有效减轻心肌缺血再灌注损伤的作用[8]。EP可以使心率增快，心输出量增加，使运动至缺血时间延长，改善心功能，减少心律失常的发生率，增强心肌对大强度运动的抵抗能力，从而发挥对心脏的强大保护作用[9]。

本研究通过检测运动后心肌组织UCP2表达水平及氧化应激水平，发现运动预适应可使急性运动性损伤的心肌组织UCP2表达水平降低，并可降低氧化应激水平，对急性运动性心肌损伤有保护作用。

力竭运动可加重心肌组织氧化应激水平，造成氧化系统激活，抗氧化系统活性降低。氧化应激可加重对心肌细胞膜及细胞器膜的破坏，导致心肌组织结构及功能的障碍，是运动性心肌损伤的重要机制。已有研究[10]发现，EP可使心肌MnSOD活性增强。本实验发现EE组较E组，力竭运动后抗氧化酶SOD及GSH-Px活性明显升高，同时氧化产物MDA浓度降低。结果说明运动预适应可通过减轻急性运动损伤后心肌组织的氧化应激水平，对心肌起到保护作用。

图1 各组UCP2mRNA相对表达量

图2 各组UCP2免疫组化切片图（×200倍）

EP提高急性力竭运动后心肌组织抗氧化酶活性，可能与EP可激活心肌细胞中多种信号转导通路有关。研究发现[11]，EP能激活心脏蛋白激酶 C（PKC），发挥其心脏保护作用。缺血预适应可触发心脏释放多种内源性活性物质，并通过与细胞膜上受体结合后激活PKC， PKC激活后磷酸化下游效应蛋白，如可激活ATP敏感性钾通道[12]等，发挥缺血预适应的心脏保护作用。PKC可上调SOD浓度，因为PKC是MnSOD活性升高的中间信号分子[13]。

另外，EP还可激活蛋白酪氨酸激酶2(JAK2)信号转导通路，发挥对心肌的保护作用。许多细胞因子或生长因子可通过JAK/STAT信号通路诱导细胞的增殖、分化或凋亡。研究发现运动预适应训练后，可使JAK2蛋白磷酸化增加，并可降低血清中游离脂肪酸浓度，加强脂肪酸氧化，保证能量供应[14]。减轻力竭运动时心肌组织缺血缺氧，并间接降低氧化应激水平。

本实验发现，运动预适应可降低力竭运动后心肌组织UCP2的表达，可使UCP2基因的mRNA转录及蛋白翻译均减少。UCP2是解耦联蛋白家族的一员，位于线粒体内膜上，可增加线粒体内膜对质子的通透性，降低线粒体内膜两侧的质子浓度差，使呼吸作用中的氧化与磷酸化作用解耦联，使能量以热能形式释放，造成能量代谢障碍。

研究发现，利用一种钙调节糖蛋白诱导UCP2蛋白表达，可削弱线粒体膜电位和抑制超氧阴离子的产生，抑制巨噬细胞中活性氧的产生[15]。UCP2能限制自由基的产生[16]，是机体遭受氧化应激损伤后的代偿性的保护反应，同时氧自由基产生增多也能反馈性使UCP2表达增多。另外UCP2加强线粒体内钙离子的转导，避免细胞内钙离子积聚[17]，同时可延长钙离子在肌质网内的转换过程，促进心肌兴奋收缩偶联，引起心肌持续收缩，这将使得心律失常的发生概率增加。UCP2作为线粒体内膜质子转运蛋白，在能量代谢、抑制ROS的生成、保护细胞免受氧化应激等方面具有重要意义。研究发现，EP可是UCP2表达量降低，可减轻力竭运动后的能量代谢障碍，同时可降低氧化应激水平，从未对力竭运动造成的心肌缺血缺氧状态有一定的抵抗作用。

综上所述：力竭运动可使心肌氧化指标浓度升高，同时抗氧化指标活性降低，并可使UCP2表达增多，导致心肌能量代谢障碍，造成心肌损伤。运动预适应可减轻力竭运动后心肌氧化应激损伤，同时可减少UCP2表达，减轻力竭运动后能量代谢障碍，对心肌运动性损伤有保护作用。

[1] Shen YJ,Pan SS,Ge J,et al. Exercise preconditioning provides early cardioprotection against exhaustive exercise in rats: potentialinvolvement of protein kinase C delta translocation[J]. Mol Cell Biochem,2012,368(1-2):89-102.

[2] 刘泽广,潘珊珊,郝哲,等. 运动预适应保护效应中大鼠心肌B型钠尿肽表达的变化[J]. 体育科学,2014,34(9):31-8.

[3] 纪丽丽,李晓燕,孟可,等. β1受体阻滞剂对力竭运动大鼠心肌能量代谢变化的影响及其机制[J]. 中国循证心血管医学杂志,2016,8(1):33-7.

[4] Margonato V,Milano G,Allibardi S,et al. Swim training improves myocardial resistance to ischemia in rats[J]. Int J Sports Med,2000,21(3):163-7.

[5] Giusti VC,Caldiz CI,Ennis IE,et al. Mitochondrial reactive oxygen species(ROS)as signaling molecules of intracellular pathways triggered by the cardiac renin-ang- iotensinⅡ-aldosterone system(RAAS)[J].Front physiol,2013,30(4):126-31.

[6] Attila O,Balázs TN,Csaba M,et al. Cardiac effects of acute exhaustive exercise in a rat model[J]. Int J Cardiol,2015,182:258-66.

[7] Huang CC,Lin TJ. Endurance training accelerates exhaustive exerciseinduced mitochondrial DNA deletion and apoptosis of left ventricle myocardium in rats[J]. Eur J Appl Physiol,2009,107(6):697-706.

[8] Powers SK,Smuder AJ,Kavazis AN,et al. Mechanisms of exerciseinduced cardiop- rotection[J]. Physiology(Bethesda),2014,29(1):27-38. [9] Parra VM,Macho P,Domenech RJ. Late cardiac preconditioning by exercise in dogs is mediated by mitochondrial potassium channels[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2010,56(3):268-74.

[10] French JP,Hamilton KL,Quindry JC,et al. Exercise-induced protection against myo- cardial apoptosis and necrosis:MnSOD,calcium-handling proteins, and calpain[J]. FASEB J,2008,22(8):2862-71.

[11] 孙晓娟,侯娜. 长期运动预适应模型大鼠心脏蛋白激酶C和热休克蛋白70的表达[J]. 中国组织工程研究与临床康复,2011,15(28):5185-8.

[12] Brown DA,Chicco AJ,Jew KN,et al. Cardioprotection afforded by chronic exercise is mediated by the sarcolemmal,and not the mitochondrial,isoform of the KATP channel in the rat[J]. J Physiol, 2005,569(Pt3):913-24.

[13] 侯云英,马志勇,范秀珍. 短期运动对大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用及其机制[J]. 苏州大学学报:医学版,2010,30(1):50-3.

[14] Zhao J,Tian Y,Xu J,et al. Endurance exercise is a leptin signaling mimetic in hypothalamus of Wistar rats[J]. Lipids Health Dis,2011,2(10):225-32.

[15] Wang Y,Huang L,Abdelrahim M. Stanniocalcin-1 suppresses superoxide genera- tion in macrophages throuhinduction of mitochondrial UCP2[J]. Leukoc Biol,2009,86(4):981-8.

[16] Dando I,Fiorini C,Pozza ED,et al. UCP2 inhibition triggers ROS-dependent nuc- lear translocation of GAPDH and autophagic cell death in pancreatic adenocarc- inoma cells[J]. Biochim Biophys Acta,2013,1833(3):672-9．

[17] Turner JD,Lawrence D,Wang G,et al. Uncoupling Protein-2 Modulates Myocar- dial Excitation-Contraction Coupling[J]. Cireulation Res,2010,106(4):730-8.

本文编辑：闫云峰，田国祥

Exercise preconditioning effect on uncoupling protein-2 expression and the oxidative stress level of myocardial tissue in exercise-induced myocardial damage

GONG Xue*, LI Xiao-yan.*Department of cardiovascular diseases, General Hospital of Jinan Military Area, Jinan, 250031, China. Corresponding author: LI Xiao-yan, E-mail: lixiaoyan902006@126.com

Objective To investigate exercise preconditioning effect on uncoupling protein-2 expression and the oxidative stress level of myocardial tissue in exercise-induced myocardial damage, and the protective effect of exercise preconditioning on acute myocardial injury.Methods30 healthy adult male Wistar rats were randomly divided into three groups (10 rats in each group): Quiet control group (C group), exhaustive exercise group (E group), exercise preconditioning and exhaustive exercise group (EE group). Sports injury model in rats was establish by a one-time acute exhaustive swimming exercise. EE group had exercise preconditioning training before acute exhaustive exercise. The exhaustion time was recorded in each group during exhaustive exercise. After exhaustion exercise testing, level of malondialdehyde (MDA) and superoxide dismutase (SOD) in myocyte mitochondria, glutathione peroxidase (GSH-Px), miRNA and protein of uncoupling protein-2 (UCP2) were measured.Results①Oxidative stress: compared with that in C group, SOD activity in the E and EE group reduced by 60.50% and 28.64% respectively (all P＜0.01); GSH-Px activity reduced by 51.23% and 39.12% respectively (all P＜0.01); MDA concentration increases 187.70% and 155.66% respectively (all P＜0.01). Compared with that in E group, SOD activity increased 80.65%, Gsh-Px activity increased 24.83%, and MDA concentration reduced by 11.14% in EE group (all P＜0.01). ②UCP2 expression: compared with that in C group, mRNA and protein expression of relative quantity in E group were significantly increased (P＜0.01), and compared with that in E group, mRNA and protein expression of relative quantity in EE group were significantly reduced (P＜0.01).Conclusions Acute sports injury can increase the expression of UCP2, and can improve the level of oxidative stress. Exercise preconditioning can reduce UCP2 expression and oxidative stress level, it plays a protective role on myocardial tissue.

Exercise preconditioning; Exercise-induced myocardial damage; Uncoupling protein 2; Oxidative stress

R542.2

A

1674-4055(2017)01-0033-04

2014全军后勤科研重大项目子项目(AWS13C008)

1250031 济南,济南军区总医院心内科

李晓燕,E-mail:lixiaoyan902006@126.com

10.3969/j.issn.1674-4055.2017.01.09