一步PCR法融合狗头枣ACOⅠ基因片段

2017-03-01陈国梁田瑞康杨成成张向前

江苏农业科学 2017年2期

关键词：狗头乙烯质粒

陈国梁，田瑞康，赵康，杨成成，安鹏，张向前

(延安大学生命科学学院/陕西省红枣重点实验室，陕西延安 716000)

一步PCR法融合狗头枣ACOⅠ基因片段

陈国梁，田瑞康，赵康，杨成成，安鹏，张向前

(延安大学生命科学学院/陕西省红枣重点实验室，陕西延安 716000)

以狗头枣ACOⅠ基因外显子Ⅲ和Ⅳ的部分序列为靶标序列，采用一步PCR法对其进行融合扩增。经与T载体连接、测序。结果表明：经一步PCR法扩增到大小为589 bp的融合基因片段，经序列比对，其与ACOⅠ外显子Ⅲ和Ⅳ序列一致性为100%。表明在一个PCR反应体系中通过4引物一次性扩增可获得融合基因，该方法是一种简便、经济、有效的融合基因构建方法。

狗头枣；ACOⅠ基因；一步PCR法

乙烯是植物主要内源激素之一，对植物的生长发育特别是果实成熟和衰老过程的调节有重要作用，是公认的果实成熟激素[1-6]。在果实的成熟过程中，乙烯的大量生成会提高与果实成熟有关酶的活性，进而促进果实的成熟[5-14]。ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-l-carboxylic acid oxidase，ACO)是植物中乙烯生物合成途径的关键酶之一，可直接催化ACC转变为乙烯[3，5]。鉴于乙烯生物合成相关基因在调控果品成熟及衰老方面的重要作用，采用生物技术对该基因调控，以便在基因水平上控制ACO的表达，则有可能从根本上解决果实延熟、抗衰老等问题。该研究选择了狗头枣ACOⅠ基因外显子Ⅲ及Ⅳ的部分基因片段[15]，通过一步PCR法将其融合，用于RNAi的植物表达载体的构建，为调控红枣ACOⅠ 基因的表达来延缓枣果的成熟，为延熟、耐储红枣新品种的培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株、质粒及试剂

菌株E.coliDH5α、质粒pGM-TACC Ⅰ(含ACOⅠ基因)均为笔者所在课题组保存，DNA回收试剂盒、TaqDNA Polymerase、限制性内切酶等购自TaKaRa公司，DNA Marker购自天为时代公司，其他试剂均为进口或国产分析纯，PCR引物合成和DNA测序由上海生工生物技术有限公司完成。

1.2 引物设计

以狗头枣ACOⅠ基因序列(登录号：JF812966.1)为依据，考虑到采用PCR拼接2个基因片段(294 bp)、1 096～1 359 bp 之间的片段(264 bp)，分别称为：F1、F2。用于扩增ACOⅠ基因片段的引物采用Oligo 7.0分析软件设计，依次为命名为3U、3RL、4RU、4L，4条引物组成如下：

3U：5′-GCGGATCCCTCGAGATGAATTGGAGACACTAG

CTGAGG-3′；

3RL 构成(含F1片段非编码链5′端23 bp和F2片段非编码链3′端22 bp)：5′-CTCTTGTATTTCCCATTTGTTATAAGGTTGACTACAA TGGAGTGG-3′；

4RU 构成(含F1片段编码链3′端22 bp和F2片段编码链5′端23 bp)：5′-CCACTCCATTGTAGTCAACCTTATAACAAATGG GAAATACAAGAG-3′；

4L 引物构成(F2片段非编码链5′端22 bp)：5′-GCATCGATGAATTCAACATTAGTTTCCACTGCTTTC-3′。

以上引物中，分别在3U、4L引物中引入17、14 bp酶切位点碱基序列(见引物中下划线部分序列)，为后续试验作准备。

1.3 一步PCR法构建融合基因

以质粒pGM-TACC Ⅰ(含融合基因F1、F2片段)DNA为模板，加入Taq酶、dNTPs、目的基因F1与F2片段的上下游引物3U、3RL、4RU、4 L各1 μL配成25 μL的反应体系。在 94 ℃ 4 min、95 ℃ 40 s、53.5 ℃ 45 s、72 ℃ 45 s的反应参数下进行5个循环后，将退火温度改为51.5 ℃、其他扩增参数不变进行5个循环，72 ℃ 3 min。再将退火温度改为53 ℃、其他扩增参数不变进行10个循环，72 ℃ 3 min。然后将 25 μL 的反应液(含Taq酶、dNTPs、 MgCl2、所设计融合基因的上、下游引物，即3U、4 L各1 μL，浓度为10 μmol/L)加入上述反应体系中；在94 ℃ 4 min、95 ℃ 40 s、54.7 ℃ 45 s、72 ℃ 1 min条件下扩增30个循环，72 ℃ 10 min，4 ℃冷却后取5.0 μL进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 融合基因片段与T载体的连接及测序

将经电泳检测大小合适的PCR产物进行回收并与T载体连接、转化、筛选、鉴定。酶切和PCR鉴定后将所得阳性克隆子(命名为pGEM-TF)委托上海生物技术有限责任公司测序。

2 结果与分析

2.1 一步PCR法构建融合基因的原理

一步PCR法构建融合基因的原理如图1所示。以质粒pGM-TACC Ⅰ为模板起初2次5个循环扩增是分别扩增出F1、F2基因片段；第3次10个循环的扩增是将已扩出来的F1、F2片段互为模板和引物进行基因融合，第4次30个循环是以形成的融合基因为模板，融合基因的上下游引物即3U与4 L为引物，获得融合基因全长序列。

2.2 F1与F2片段的一步PCR融合扩增结果

将上述扩增得到的PCR产物取5 μL进行琼脂糖凝胶电泳，结果(图2)获得大小约590 bp的特异条带，与预期片段大小符合。初步表明2片段已按设计融合在一起。

2.3 基因融合产物的酶切与测序结果

将经筛选获得的重组质粒pGEM-TF，经PCR和双酶切进行鉴定，结果(图3、图4)表明，PCR扩增及酶切片段的大小均为590 bp，与预期大小一致，说明融合基因片段已连至载体。经测序及序列比对，结果与GenBank中的序列完全一致。进一步确定以含目的基因的质粒pGM-TACC Ⅰ为模板，通过一步PCR法成功获得了狗头枣ACOⅠ基因序列中F1和F2片段的融合基因。

3 结论与讨论

重叠延伸PCR技术是采用具有互补末端的引物，使PCR产物形成重叠链并在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸，将不同来源的扩增片段拼接起来。利用该技术不需要内切酶消化和连接酶处理即可进行有效的基因重组，能较快获得依靠限制性内切酶消化的方法难以得到的产物。通过精心设计引物，利用该技术可将2条以上的基因构建成为融合基因，如Shevchuk等利用重叠延伸PCR技术成功地将多个DNA片段连接在一起[16-19]。此外重叠延伸PCR在基因的定点突变、长片段基因的合成、构建重组质粒和载体、基因敲除以及目的基因的扩增等方面有其广泛而独特的应用[20-26]。

一步PCR法融合ACOⅠ基因外显子Ⅲ及Ⅳ的部分基因片段也属于重叠延伸PCR法，但其优点是不需要将单个PCR产物回收再融合即只需要构建1个PCR反应就可以得到融合基因。在达到融合目的的同时，缩短了试验周期，节约了成本，减少了操作环节，为重叠延伸PCR法的应用提供了新的选择。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.007

2015-12-11