单细胞水平原钙黏蛋白基因簇的转录分析

陈志锋， 彭 莱， 吴 强，

(1.上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240；2.上海交通大学系统生物医学研究院比较生物医学中心/系统生物医学教育部重点实验室，上海 200240)

单细胞水平原钙黏蛋白基因簇的转录分析

陈志锋1， 彭 莱2， 吴 强1，2

(1.上海交通大学生命科学技术学院，上海 200240；2.上海交通大学系统生物医学研究院比较生物医学中心/系统生物医学教育部重点实验室，上海 200240)

原钙黏蛋白(protocadherin，Pcdh)基因簇由紧密相连的3个基因簇(Pcdhα、Pcdhβ和Pcdhγ)组成，其中α、β基因簇包含可变区外显子(C型和非C型)和恒定区外显子。这种独特的基因排列方式使Pcdh基因簇具有产生单细胞分子多样性的潜能。目前，在单细胞水平有关Pcdh基因簇转录表达的研究较少。为了探索单细胞Pcdh基因簇的转录表达模式，利用显微操作系统并结合RT-PCR方法，在单细胞水平分析了小鼠大脑皮层和人类神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH的Pcdhα和Pcdhβ基因簇表达模式。研究发现Pcdhα和Pcdhγ的C型和非C型亚型均是随机表达，每个单细胞表达不同组合的若干个Pcdh基因簇亚型。本研究表明，在小鼠大脑皮层及人类神经母细胞瘤的单个细胞中，Pcdh基因簇的转录表达都能够产生单细胞表面分子多样性。这为进一步揭示神经元中Pcdh基因簇表达调控的分子机理及其在大脑神经回路中的功能奠定理论基础。

原钙黏蛋白基因簇；表达模式；单细胞；RT-PCR；单细胞表面分子多样性

哺乳动物的神经系统中含有上亿个神经元，这些神经元通过突触结构形成复杂而有序的信号通讯网络，不同神经元之间是如何有效地相互识别，进而相互连接，形成复杂的神经环路，这一直都是神经科学领域亟待解决的重要基础性课题。有研究提出每个神经元都含有其特异性的身份识别标签[1-2]，这些标签具有分子多样性，可以用来区别于其他神经元，指导不同神经元之间特异性识别，保证神经环路的正确形成。在哺乳动物系统中，何种蛋白能够产生单细胞的分子多样性呢？近年来，在脊椎动物中所独有的、进化过程中高度保守的原钙黏蛋白基因簇引起了人们的关注。原钙黏蛋白基因簇由3个串联排列的基因簇Pcdh(α、β和γ)组成，其中Pcdhα和Pcdhγ基因簇包含C型和非C型可变外显子组成的可变区以及3个恒定区外显子组成的恒定区[3-4](图1)。小鼠Pcdhα基因簇可变区包含12个非C型可变外显子(α1～α12)和2个C型可变外显子(αc1～αc2)，小鼠Pcdhγ基因簇可变区包含19个非C型可变外显子(γa1～γa12，γb1～γb8，但没有γb3)和3个C型可变外显子(γc3～γc5)(图1-A)；人的Pcdhα基因簇可变区包含13个非C型可变外显子(α1～α13)和2个C型可变外显子(αc1～αc2)，人的Pcdhγ基因簇可变区包含19个非C型可变外显子(γa1～γa12，γb1～γb7)和3个C型可变外显子(γc3～γc5)(图1-B)。在转录时，通过启动子选择和顺式可变剪接作用，使可变区外显子与3个恒定区外显子相连，最终形成由可变区外显子编码的胞外结构域(含有6个胞外结构域，即EC1～EC6)、跨膜结构域和恒定区外显子编码的胞内结构域组成的原钙黏蛋白分子[5-6](图1)。因此，不同可变外显子形成不同原钙黏蛋白的组合具有产生单细胞多样性的潜能。

Yagi等对P21小鼠蒲肯野细胞Pcdh基因簇的表达模式进行了研究，认为Pcdhα和Pcdhγ基因簇C型亚型组成型表达，即每个单细胞都表达C型亚型，而非C型亚型随机表达[7-9]。这为单细胞Pcdh基因簇表达的分子多样性提供了初步的证据，但这种表达模式的发现只是基于小鼠一个发育时期和一种细胞类型的研究，其普遍性有待验证。在小鼠大脑皮层细胞中Pcdh基因簇以怎样的模式表达，是否具有多样性，目前还不清楚。另外，有研究表明，在人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH中Pcdhα和Pcdhγ基因簇表达特定亚型的组合[10]，那么在单细胞水平，每个SK-N-SH细胞是否都表达这些特定亚型的组合，单细胞Pcdhα和Pcdhγ基因簇的转录表达是否具有多样性，尚不清楚。

通过转录分析手段如逆转录PCR(RT-PCR)[11]的方法可以得到细胞中基因表达的信息，常规的RT-PCR方法至少需要上万个细胞。这种群体细胞转录分析方法得到的是一群细胞基因表达的综合信息，但是无法知道单细胞内基因表达的情况以及单细胞间基因表达的差异。只有将单细胞技术(单细胞显微操作技术等)与转录分析技术结合，将RT-PCR等转录分析方法直接应用于单个细胞的研究，才能揭示单个细胞中基因表达的真实情况，才能比较不同细胞间基因表达的差异[12]。

本研究利用根据Smart-Seq2[13]的部分步骤改进而来的单细胞RT-PCR的方法探索了P0小鼠大脑皮层细胞和 SK-N-SH 细胞系原钙黏蛋白基因簇Pcdhα和Pcdhγ的表达模式，发现所有亚型的转录表达都是随机的，不同单细胞随机表达不同亚型的组合，从而赋予单个细胞原钙黏蛋白基因簇表达的分子多样性，为原钙黏蛋白作为神经元特异性身份识别标签参与神经回路的形成提供了新的证据，为进一步揭示单个神经元中原钙黏蛋白基因簇表达的分子机理奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 小鼠与细胞系 小鼠为B6野生型小鼠，购于南京大学模式动物研究所；SK-N-SH细胞系为人神经母细胞瘤细胞系，购于上海细胞库。

1.1.2 试验试剂 1×TrypLE Express enzyme，no phenol red(12604-021)购于Gibco公司；Triton X-100(T9284)购于Sigma-Aldrich公司；dNTP Mix(R0192)购于Fermentas公司；5×First-strand buffer(18064-014)购于Invitrogen公司；DTT(18064-014)购于Invitrogen公司，Superscript Ⅱ逆转录酶(18064-014)购于Invitrogen公司；重组核酸酶抑制剂(2313A)购于Clontech公司；Betaine(61962)购于Sigma-Aldrich公司；MgCl2(M8266)购于Sigma-Aldrich公司；KOD-Plus-Neo(KOD-401)购于TOYOBO公司；TaqPCR Master Mix(BS9298)购于BBI公司；FBS(10099-141)购于Gibco公司；DMEM/ High Glucose(SH30243.01B)购于Thermo公司；Papain(P4752-50MG)、DNaseⅠ(DN25-10MG)购于Sigma公司。

1.1.3 实验仪器 Laser based micropipette puller系统(美国Sutter Instrument 公司)；XenoworksTMMicromanipulator(美国Sutter Instrument公司)；Mini Vortexer(82019-170)美国VWR公司；Leica Microsystems(德国Leica公司)；5810R离心机(德国Eppendorf公司)；PCR仪(美国Applied Biosystems公司)；电泳仪(美国Bio-Rad公司)；Forma 902超低温冰箱(美国Thermo公司)；Forma series Ⅱ细胞培养箱(美国 Thermo 公司)。

1.1.4 引物 本研究所用引物(表1)均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 本研究所用引物

1.2 方法

1.2.1 细胞系的单细胞悬浮液制备 于长满有SK-N-SH细胞系的60 mm培养皿中，弃培养基；加入2 mL 37 ℃ PBS溶液，然后去除PBS；加入1 mL 37 ℃胰蛋白酶消化3 min；加入1 mL 37 ℃培养基终止消化，用移液枪轻轻吹打细胞；取 200 μL 细胞液于15 mL离心管中，再加入1 mL培养基和 1 mL 胰蛋白酶溶液进行稀释，置于冰上待用。

1.2.2 小鼠大脑皮层的酶消化分离溶液的制备 称量1 mg木瓜蛋白酶于1.5 mL离心管中，加入1 mL DMEM-High Glucose培养基和1 μL 1 mg/mL DNaseⅠ并混匀，置于37 ℃水浴锅中待用。

1.2.3 小鼠大脑皮层的单细胞悬浮液制备 使用高压灭菌后的外科手术器械取下P0时期的小鼠大脑，置于冰浴 DMEM-High Glucose培养基中；用尖细的镊子取少量大脑皮层放入酶消化分离溶液中，37 ℃消化15 min；除去上层液体，加入 1 mL DMEM-High Glucose和FBS的混合液(9 ∶1)清洗，用移液枪吹散细胞；并使用100 μm孔隙滤膜过滤；400 r/min离心5 min除去上层液体，加入1 mL DMEM-High Glucose和FBS的混合液，重悬细胞，置于冰上待用。

1.2.4 单细胞的挑取与裂解 准备工作：(1)单细胞裂解缓冲液的配制：将0.2%体积分数的Triton X-100溶液、RNA酶抑制剂和DTT(100 μmol/L)按95 ∶5 ∶1的比例混合，并充分混匀。(2)10 μmol/L特异性逆转录引物(表1)溶液的配制：将10 μL 100 μmol/L的特异性逆转录引物溶液和90 μL无核酸酶超纯水充分混匀。(3)单细胞裂解混合液的配制：将单细胞裂解缓冲液、特异性逆转录引物溶液和10 mmol/L dNTP mix溶液按2 ∶1 ∶1的比例充分混合均匀。

操作步骤：将单细胞悬液与台盼蓝按9 ∶1比例混合，并充分混匀；取100 μL上述混合液涂在载玻片上，置显微镜下，静置1 min；在显微镜下用毛细玻璃移液管吸取单个细胞(图2-c)；将吸入的单细胞吹出(伴随有0.3 μL液体)至含有 4 μL 的单细胞裂解混合液PCR管的盖子中(图2-d)；将含有单细胞的盖子盖回PCR管，立即涡旋并放置于冰上；17 000 r/min 离心15 s；将样品放置在72 ℃水浴锅中恒温加热3 min后，瞬时离心并立即置于冰上。

1.2.5 单细胞样品逆转录反应 解冻逆转录反应各试剂，并混匀；混合以下组分：0.25 μL重组RNA酶抑制剂(40 U/μL)，2.00 μL Superscript Ⅱ first-strand buffer(5×)，0.5 μL DTT(100 mmol/L)，2.00 μL Betaine(5 mol/L)，0.06 μL MgCl2(1 mol/L)，0.10 μL TSO(100 μmol/L)，0.29 μL Nuclease-free water，0.50 μL SuperScriptⅡ逆转录酶(200 U/μL)；将混合组分加入到单细胞样品中，并混匀；离心700 r/min 10 s并立即放置冰上；设置以下反应参数进行逆转录：42 ℃ 90 min；50 ℃ 2 min，42 ℃ 2 min，10个循环；70 ℃ 15 min。

1.2.6 单细胞样品PCR预扩增反应 依次向PCR试管中加入以下组分并充分混匀，2.5 μL KOD-Plus-Neo聚合酶 10×PCR缓冲液，2.5 μL 2 mmol/L dNTP，0.25 μL ISPCR primers(10 mol/L)，9.25 μL无核酸酶的超纯水，0.5 μL KOD-Plus-Neo 聚合酶；加15 μL PCR预扩增反应的混合液于单细胞样品中，使最终反应体系为25 μL，充分混匀，以 700 r/min 离心10 s并置于冰上；PCR反应参数：98 ℃ 3 min；98 ℃ 20 s，67 ℃ 15 s，72 ℃ 4 min，30个循环；72 ℃ 5 min。

1.2.7 单细胞Pcdh基因簇亚型特异性PCR 于PCR管中加入1 μL稀释了2倍的PCR预扩增反应产物，并向PCR管中依次加入以下组分：5 μLTaqPCR Master Mix，0.4 μL Primer F(10 μmol/L)，0.4 μL Primer R(10 μmol/L)，3.2 μL去离子水；PCR反应参数：94 ℃ 4 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35个循环；72 ℃ 7 min；琼脂糖凝胶电泳，根据Pcdhα和Pcdhγ各亚型对应条带的有无来判断亚型是否表达。

2 结果与分析

2.1 小鼠大脑皮层单细胞Pcdhα基因簇的转录分析

首先，取P0时期小鼠大脑皮层，通过普通RT-PCR和琼脂糖凝胶电泳分析大脑皮层群体细胞中Pcdhα各个亚型的表达情况。由图3可知，在群体细胞水平上，大脑皮层细胞表达所有的Pcdhα亚型。

图4为单细胞RT-PCR分析P0小鼠大脑皮层Pcdhα亚型表达的结果。由图4可知，所有细胞都表达Pcdhα，但并不是每个细胞都表达C型亚型，如有6个细胞表达αc2，有1个细胞表达αc1。在非C型亚型中，有的非C型亚型没有被检测到表达，如α1、α6，有的非C型亚型在3个细胞中被检测到表达，如α7、α11等，因此，表达不同亚型的细胞个数不同。由图4纵向看，每个细胞表达不同的Pcdhα亚型组合，如2#表达α4和α8的组合，14#表达α2、α5和αc2的组合。

以上结果表明，在P0小鼠的大脑皮层单细胞中，PcdhαC型亚型(αc1和αc2)和非C型亚型的表达是随机的，单细胞随机选择表达这些亚型的组合，单细胞间Pcdhα的表达具有多样性。

2.2 小鼠大脑皮层单细胞Pcdhγ基因簇的转录分析

由图5可知，群体细胞水平上，P0小鼠大脑皮层细胞表达所有Pcdhγ亚型的组合。

图6为14个(1#～14#)小鼠(P0)大脑皮层单细胞Pcdhγ各个亚型表达的情况。每个细胞都表达Pcdhγ，71%(10/14)的细胞表达C型亚型γc3，只有21%(3/14)的细胞表达γc4，这批细胞中没有检测到表达γc5的细胞，PcdhγC型亚型(γc3、γc4和γc5)是随机表达的。另外，表达不同非C型亚型的细胞个数差异很大，有的非C型亚型不表达，如γa8、γb5等等，而有的非C型亚型在多个细胞中被检测到表达，如有6个细胞表达γa11。不同单细胞间表达γ亚型的种类数也相差很大，有的细胞表达1～2种Pcdhγ亚型，如12#只表达γb4，6# 只表达γb2和γc3，而有的细胞表达5种Pcdhγ亚型组合，如3#表达γa3、γa4、γa6、γa11和γc3的组合，4#表达γa4、γb2、γa7、γa12和γc3的组合。

综合以上结果分析，小鼠(P0)的大脑皮层单细胞Pcdhγ亚型的表达是随机的，每个细胞随机选择表达不同的Pcdhγ亚型组合，单细胞Pcdhγ的表达具有多样性。

2.3 SK-N-SH细胞系中单细胞Pcdhα基因簇的转录分析

SK-N-SH是人神经母细胞瘤细胞系，以往研究表明，在群体细胞水平，该细胞系Pcdhα基因簇表达α4、α8、α12、αc1和αc2等5种亚型[10]。

如图7所示，这批细胞中只有α4、α12和αc2被检测到表达，只有6个细胞被检测到表达Pcdhα，由图7可知，4#、10#和15#都只表达α12，11#和18#都只表达Pcdhα4，13#只表达Pcdhαc2。结果表明，并不是每个SK-N-SH细胞都表达一样的Pcdhα特定亚型组合，单细胞Pcdhα的表达具有多样性。

2.4 SK-N-SH细胞系中单细胞Pcdhγ基因簇的转录分析

前期研究表明，在群体细胞水平上，SK-N-SH细胞系Pcdhγ基因簇表达γb1、γa4、γb2、γb3、γa7、γb5、γa9、γa10、γb7、γc3、γc4和γc5等12种亚型[10]。由于Pcdhγ基因簇结构的独特性[3]，笔者推测，每个SK-N-SH细胞随机表达Pcdh基因簇的亚型，每个细胞表达不一样的Pcdhγ亚型组合。由于细胞群体的Pcdh基因簇表达是所有单细胞Pcdh基因簇综合表达的结果，群体细胞稳定表达特定亚型的组合。

如图8所示，用单细胞RT-PCR的方法全面分析了36个SK-N-SH单细胞(图8A，1#～20#；图8B，21#～36#)所有Pcdhγ亚型表达的情况，每个SK-N-SH细胞都会表达Pcdhγ，94%(34/36)的细胞表达C型亚型Pcdhγc3，表达Pcdhγc4和Pcdhγc5的细胞分别占细胞总数的8%(3/36)和44%(16/36)。在非C型亚型中，有的非C型亚型没有被检测到表达，如γa3等；有的非C型亚型在大部分细胞中被检测到表达，如γb7。从纵向看图8，并不是所有细胞都表达相同的特定某些Pcdhγ亚型组合，有的细胞表达亚型的种类多，如3#表达γa4、γb2、γa7、γb7、γc3和γc5的组合，有的细胞表达亚型的种类少，如19#表达γa7和γb7，29#表达γb7和γc3，32#表达γa7和γc3。

以上结果分析表明，在SK-N-SH细胞系单细胞中，Pcdhγ亚型的表达是随机的，有的亚型表达几率大，有的亚型表达的几率小，不同SK-N-SH单细胞表达不同的Pcdhγ亚型组合，单细胞Pcdhγ的表达具有多样性。

3 结论与讨论

哺乳动物的神经系统由数以亿计的神经元组成，神经元之间通过多样而特异的突触连接用以交流和传递信息。原钙黏蛋白可能在复杂的神经系统中扮演重要角色，如原钙黏蛋白介导树突的自我回避[14]，决定神经元的存活[15-16]，调控树突的形成与发育[17-18]，指导突触的发育[19-20]等等。有研究认为每个神经元的表面都有其自身特异性的身份识别标签，这些标签具有分子多样性的特征，用以指导不同神经元间特异性识别[1-2]。而原钙黏蛋白基因簇独特的排列方式及其在中枢神经系统的特异性表达[3-4]表明其在神经元中具有产生原钙黏蛋白分子多样性的潜能，可能作为神经元的身份识别标签参与到神经回路的形成中。但哺乳动物许多神经元(如大脑皮层细胞等)中的原钙黏蛋白基因簇表达是否真的都具有分子多样性，这还不清楚。

前人对小鼠(P21)蒲肯野细胞原钙黏蛋白基因簇的表达模式进行了研究，为神经元产生原钙黏蛋白的分子多样性提供了直接的试验证据。Yagi等基于小鼠(P21)蒲肯野细胞的研究提出了原钙黏蛋白基因簇独特的表达模式，认为原钙黏蛋白基因簇的C型亚型组成型表达，即每个神经元都表达C型亚型，而其他非C型亚型随机性表达[9]。但小鼠(P21)蒲肯野细胞Pcdh基因簇的这种表达模式是否具有普遍性，并且在小鼠大脑皮层中Pcdh基因簇的转录表达是否具有多样性，目前仍不清楚。另外，有关研究表明，SK-N-SH细胞系会稳定表达某些特定亚型的组合[10]。但在单细胞水平，每个SK-N-SH细胞是否都表达这些特定亚型的组合，Pcdh基因簇的转录表达是否具有多样性，这还尚未清楚。

常规的基因表达的转录分析是利用逆转录PCR[11]或RNA-Seq[21]的方法从群体细胞水平分析群体细胞基因表达的综合情况，但这样得到的结果是所有细胞基因表达的平均水平，没法得到单个细胞中各基因表达的情况，没法区分单细胞间基因表达的差异，因此，只有将基因转录分析方法直接运用于单个细胞，才能揭示单个细胞中基因表达的信息，才能比较单细胞间基因表达的差异。

本研究通过单细胞RT-PCR的方法分析了小鼠(P0)大脑皮层和SK-N-SH单细胞中原钙黏蛋白基因簇的表达模式，发现C型和非C型亚型的表达均是随机的，每个神经元随机选择表达不同的原钙黏蛋白基因簇亚型组合，Pcdh基因簇的转录表达在单细胞中具有多样性。原钙黏蛋白基因簇转录表达的多样性为其作为神经元身份识别标签参与神经回路的形成提供了新的证据，也为进一步从单细胞水平研究原钙黏蛋白基因簇转录表达多样性的分子机理奠定了基础。有研究表明，在双相情感障碍和自闭症等多种精神类疾病中，均伴随有神经回路形成缺陷[22-23]，本研究也为系统理解精神类疾病的发病机制提供理论参考。

近年来，随着单细胞检测技术的不断发展，人们可以将转录组高通量测序(RNA-Seq)技术运用于单细胞的研究，各种单细胞RNA-Seq技术相继涌现，如scRNA-Seq[24]、Smart-Seq[25]、Smart-Seq2[13，26]等等，各种单细胞转录组高通量测序技术形式各异，但本质上都是为了更加真实全面地得到单细胞中转录组的全部信息。因此，将来可以在已有研究的基础上利用单细胞RNA-Seq技术，对各个发育阶段小鼠大脑皮层单细胞和神经系统其他组织的单细胞进行高通量测序，不仅可以获得各种细胞中原钙黏蛋白基因簇表达的亚型种类，还可以获得各亚型的表达水平，从而更进一步地揭示原钙黏蛋白基因簇表达的分子多样性，还可以进一步研究单细胞原钙黏蛋白基因簇组合型的表达模式是否受时空调控，为原钙黏蛋白作为神经元特异性身份识别标签参与神经回路的形成提供更多的证据。

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10.15889/j.issn.1002-1302.2017.02.010

2016-01-26

国家自然科学基金(编号：91519302，812111583)；中国博士后科学基金(编号：2015M571558)；上海市科学技术委员会科研计划(编号：14JC1403601)。

陈志锋(1989—)，男，江西赣州人，硕士研究生，主要从事生物化学与分子生物学研究。E-mail：chenzf2013@qq.com。

吴 强，教授，博士生导师，主要从事分子细胞生物学和神经发育生物学研究。Tel：(021)34204300；E-mail：qiangwu@sjtu.edu.cn。

Q786

A

1002-1302(2017)02-0038-06

陈志锋，彭 莱，吴 强. 单细胞水平原钙黏蛋白基因簇的转录分析[J]. 江苏农业科学，2017，45(2)：38-43.