龙利叶多酚提取条件优化及其抗氧化活性研究

张素斌，张 欣，李 敏

(肇庆学院 化学化工学院，广东 肇庆 526061)

龙利叶多酚提取条件优化及其抗氧化活性研究

张素斌，张 欣，李 敏

(肇庆学院 化学化工学院，广东 肇庆 526061)

在单因素试验的基础上，采用正交试验优化龙利叶中多酚的提取工艺，并研究其抗氧化活性，以期为龙利叶多酚的开发应用提供理论依据。提取剂采用乙醇溶液，研究乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间、提取次数这5个因素对龙利叶多酚提取的影响。结果表明，龙利叶多酚最优提取条件如下：乙醇体积分数60%、料液比1︰30、提取时间30 min、提取温度60 ℃。在此条件下龙利叶多酚的得率为4.38 mg/g。龙利叶多酚清除DPPH·自由基的半抑制浓度(IC50)为1.91 g/mL，抗坏血酸的IC50为6.75 g/mL。还原力的测定中，当吸光度同为0.5时，龙利叶多酚与抗坏血酸质量浓度分别为9.94 g/mL与32.06 g/mL，表明龙利叶多酚对DPPH·自由基的清除能力以及还原力均强于抗坏血酸。

龙利叶； 多酚； 提取； 正交试验； 抗氧化活性

龙利叶(SauropusrostratusMiq.)为大戟科守宫木属植物，又名龙脷叶、龙舌叶，主产于我国的广东、广西以及海南等地[1]。中医认为其能清热止咳、润肺化痰，在呼吸道炎症等疾病的治疗中有独特疗效[2]。除了药用外，龙利叶在岭南地区通常被用作传统的凉茶和食疗材料，人们常将其与猪瘦肉同煲汤后饮用，肉汤鲜美且可用于清肺、化痰止咳。相关的龙利叶研究文献较少，且多为研究其化学成分及药理作用。汪小根等[3]用气-质联用法分析龙利叶挥发油的成分，鉴定出其含有棕榈酸(28.43%)、金合欢基丙酮(8.82%)，并且含有单萜、倍半萜、醛、酮、烯、酚、醇、酯、烷烃、脂肪酸类等物质。何鹏等[4]发现,龙利叶中含有单萜、倍半萜、香豆素、黄酮苷等多种活性成分。植物多酚广泛存在于植物的皮、叶、根及果肉中[5]，对于清除体内自由基具有很大的功效[6]。由于植物多酚具有多种生理活性作用，对植物多酚的研究有很多文献报道[7-13]，至今仍是研究热点，并且向纵深的方向发展，如研究多酚物质对某些疾病的作用机制[14-16]。开展对植物多酚的研究有利于拓宽植物多酚的来源，以获取具有多种用途的多酚物质，并应用于食品、药品和化妆品等领域。然而，至今尚未见龙利叶多酚的提取及其抗氧化能力方面的研究文献。鉴于此，通过单因素试验和正交试验，研究龙利叶多酚物质的最优提取工艺，并以抗坏血酸为对照品，研究所提取的龙利叶多酚溶液的还原力以及对DPPH·自由基的清除能力，以评价其抗氧化能力。

1 材料和方法

1.1 材料与仪器

龙利叶干品购于肇庆市桥东市场。试剂：没食子酸、酒石酸钾钠、硫酸亚铁、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、乙醇、抗坏血酸、铁氰化钾、氯化铁、1,1-二苯基-2-苦基肼自由基(DPPH·)。仪器：754型紫外可见光分光光度计(上海菁华科技有限公司)、PHS-25(数显)pH计(上海精密科学仪器有限公司)、AUY120型电子分析天平(日本岛津公司)。

1.2 试验方法

1.2.1 龙利叶中多酚含量的测定 多酚含量的测定采用酒石酸亚铁比色法[17]。准确吸取0.1 mg/mL没食子酸标准溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，先后加入2.0 mL的酒石酸亚铁溶液以及pH值7.5 的磷酸缓冲溶液，以蒸馏水定容至10 mL，在540 nm处测定吸光度A，以没食子酸质量浓度c(mg/mL)为横坐标、A为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为A=14.394c-0.004 1，r=0.999 5。

准确吸取2.0 mL样液，按上述标准曲线制作的方法加入显色试剂并测定吸光度，将A代入标准曲线计算测定用样液中的多酚质量浓度c(mg/mL)，再根据样品质量m(g)、定容体积V(mL)以及稀释倍数n，按以下公式计算龙利叶多酚得率(mg/g)[18]：

1.2.2 龙利叶中多酚提取的单因素试验 将龙利叶干品粉碎，过0.600 mm孔径筛，密封备用。测得其水分含量为14.30%。称取1 g龙利叶样品，固定以下初始试验条件：料液比为1︰30(g/mL，下同)、提取温度40 ℃、提取时间30 min，首先对乙醇体积分数(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)进行单因素试验，将提取液过滤并定容，然后按1.2.1试验方法测定并计算得出龙利叶多酚得率，根据得率选择最优乙醇体积分数。后续试验均根据前一个单因素试验所得的最优条件及前述初始试验条件设置固定的试验条件，依次对料液比(1︰10、1︰20、1︰30、1︰40、1︰50、1︰60)、提取温度(40、50、60、70、80 ℃)、提取时间(10、20、30、40、50、60 min)、提取次数(1、2、3次)进行单因素试验。

1.2.3 龙利叶中多酚提取的正交试验 根据单因素试验结果，选择乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间4个试验因素进行正交试验，各因素均设置3个试验水平(表1)，以龙利叶多酚得率为评价指标，用L9(34)正交表安排试验，每个试验方案进行3次重复。

表1 龙利叶多酚提取正交试验因素和水平

1.2.4 龙利叶多酚抗氧化活性试验 按正交试验最优条件提取龙利叶多酚得到提取液，按1.2.1方法测定多酚含量，作为测定抗氧化活性试验研究的样品，分别进行以下抗氧化活性试验。

1.2.4.1 龙利叶多酚还原力的测定 采用黄俊丽等[19]的铁氰化钾还原法测定还原力。配制一系列质量浓度的龙利叶多酚样液，以抗坏血酸做对照品进行试验，测定体系吸光度并比较龙利叶多酚和抗坏血酸的还原力。

1.2.4.2 龙利叶多酚对DPPH·自由基清除能力的测定 参照高玉萍等[20]的方法稍作修改，将1.27×10-4mol/L DPPH·的无水乙醇溶液2 mL和样液2 mL混匀，室温下避光反应30 min，在517 nm处测定吸光度A1，并测定样品溶液加无水乙醇的吸光度A2以及DPPH·溶液加样品溶剂的吸光度A3。另采用同种方法测定抗坏血酸清除DPPH·自由基的能力。按下式计算清除率：清除率=[1-(A1-A2)/A3]×100%。

2 结果与分析

2.1 龙利叶中多酚提取的单因素试验

2.1.1 乙醇体积分数对龙利叶多酚得率的影响 按1.2.2的试验方法对乙醇体积分数(10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%)进行单因素试验。结果表明，加入70%乙醇所得的龙利叶多酚提取液，加入显色剂后溶液变混浊，不能测定其吸光度，而体积分数低于70%的乙醇均无此现象，因此，后续试验选择的乙醇体积分数为10%～60%。由图1可知，龙利叶中多酚得率随乙醇体积分数的升高呈增加的趋势，但在10%～50%时得率增加平缓，当乙醇体积分数为60%时得率明显增大，提取效果最佳，故选用60%乙醇为提取剂。

图1 乙醇体积分数对龙利叶多酚得率的影响

2.1.2 料液比对龙利叶多酚得率的影响 由图2可知，当料液比为1︰30与1︰40时，多酚得率效果较好，料液比太高或太低均使龙利叶多酚得率下降。故料液比选择1︰30进行后续试验。

图2 料液比对龙利叶多酚得率的影响

2.1.3 提取温度对龙利叶多酚得率的影响 由图3可知，在40～60 ℃时，随着提取温度增高，多酚得率增加，在提取温度为60 ℃时多酚得率最高，说明适当增加温度，有助于多酚物质的溶出，但再继续提高温度，多酚得率反而降低，可能是因为温度太高会破坏多酚物质[21]，故选用提取温度为60 ℃。

2.1.4 提取时间对龙利叶多酚得率的影响 由图4可知，在提取时间为10 min时，因时间较短，多酚仅有少量溶出，因而得率最低，随着提取时间增加，龙利叶中多酚得率增加，30 min时多酚得率最高，继续增加时间，多酚得率反而缓慢下降，故选用提取时间为30 min。

图3 提取温度对龙利叶多酚得率的影响

图4 提取时间对龙利叶多酚得率的影响

2.1.5 提取次数对龙利叶多酚得率的影响 结果表明，随着提取次数的增加，龙利叶多酚的得率仅略有提高，提取2次(4.50 mg/g)、3次(4.58 mg/g)分别比提取1次(4.36 mg/g)的多酚得率增加3.2%、5.0%，从节约成本和时间考虑，选择提取次数为1次。

2.2 龙利叶多酚提取的正交试验

选择L9(34)正交表安排试验，A、B、C、D列均按表1安排试验因素，因正交表未留有空列，为进行方差分析，每一号试验方案均进行重复试验[22]，结果见表2。由表2可知，4个因素对龙利叶多酚得率的影响大小顺序为A、B、D、C，即乙醇体积分数>提取温度>料液比>提取时间。最优提取方案为A1B1C2D3，故确定最优提取条件为：乙醇体积分数60%、温度60 ℃、时间30 min、料液比1︰30。

表2 龙利叶多酚提取的正交试验结果

方差分析结果显示，乙醇体积分数[F=48.79>F0.01(2，9)=8.02]、提取温度[F=14.26>F0.01(2，9)=8.02]对多酚得率的影响均极显著；料液比[F=5.97>F0.05(2，9)=4.26]对多酚得率影响显著；而提取时间[F=3.23

根据正交试验结果得到的最优方案A1B1C2D3进行验证试验，测得龙利叶多酚得率为4.38 mg/g，RSD=0.18%(n=4)，高于表2中的结果，表明最优方案A1B1C2D3所得多酚得率较高，为龙利叶多酚的最佳提取条件。

2.3 龙利叶多酚的抗氧化活性

2.3.1 龙利叶多酚的还原力 还原力是评价物质抗氧化活性的指标之一，还原力越强，抗氧化性越强[23]。由图5可知，随着质量浓度增加，龙利叶多酚和抗坏血酸还原能力都逐渐增强，说明龙利叶多酚和抗坏血酸都有良好的还原能力。将龙利叶多酚及抗坏血酸的质量浓度与其吸光度进行线性拟合，都呈良好的量效关系，拟合方程分别为y=0.045 2x+0.050 6(R2=0.992 6)和y=0.015x+0.018 6(R2=0.981 6)。当吸光度同为0.5时，龙利叶多酚质量浓度为9.94 g/mL，抗坏血酸质量浓度为32.06 g/mL，龙利叶多酚拟合方程的斜率为0.045 2，高于抗坏血酸的0.015，说明在相同质量浓度下，龙利叶多酚还原体系的吸光度要大于抗坏血酸还原体系的吸光度，即龙利叶多酚的还原能力要强于抗坏血酸。

图5 龙利叶多酚及抗坏血酸的还原力

2.3.2 龙利叶多酚对DPPH·自由基的清除作用 DPPH·自由基是一种具有稳定氮中心的自由基，其溶液在可见光区有较强吸收，抗氧化剂的加入能将其清除，使溶液的紫色退去并且吸光度减小[24]。由图6可知，龙利叶多酚和抗坏血酸对DPPH·自由基均具有清除效果，DPPH·自由基清除率与龙利叶多酚和抗坏血酸质量浓度都呈良好正相关，拟合方程分别为y=23.5x+5.102(R2为0.983 1)和y=5.066 9x+15.781(R2为0.934 9)。龙利叶多酚的半抑制浓度(IC50)为1.91 g/mL，抗坏血酸的IC50为6.75 g/mL。因此，龙利叶多酚对DPPH·自由基的清除能力要强于抗坏血酸。

图6 龙利叶多酚及抗坏血酸对DPPH·自由基的清除作用

3 结论与讨论

龙利叶为岭南地区民间常用药用及食用材料，有润肺止咳等功效，却鲜有对其中所含生理活性物质的研究。已有的研究表明,龙利叶化学物质中含有酚类物质，但未见进一步研究。本研究采用乙醇溶液提取龙利叶中的酚类物质，并研究该酚类粗提物的抗氧化活性，以期能更深入研究龙利叶中的生理活性物质，从而获取性能优良的天然抗氧化剂。通过单因素试验，考察了乙醇体积分数、料液比、提取温度、提取时间和提取次数对龙利叶多酚得率的影响，以单因素试验结果为基础，再采用L9(34)正交表，通过正交试验得到最优提取条件，即乙醇体积分数为60%，提取温度为60 ℃，提取时间为30 min，料液比为1︰30，在此条件下，龙利叶的多酚得率为4.38 mg/g。方差分析结果表明，乙醇体积分数、提取温度对龙利叶多酚得率的影响极显著，料液比对多酚得率影响显著，提取时间对多酚得率无显著影响。

相对于抗坏血酸，龙利叶多酚显示较强的抗氧化活性。还原力的测定中，当吸光度同为0.5时，龙利叶多酚与抗坏血酸质量浓度分别为9.94 g/mL与32.06 g/mL。龙利叶多酚清除DPPH·自由基的IC50为1.91 g/mL，而抗坏血酸的IC50为6.75 g/mL。试验结果表明，龙利叶多酚对DPPH·自由基的清除能力以及还原力均要强于抗坏血酸。若能对本试验所提取的多酚物质进一步分离纯化，并研究其酚类物质的组成，则可为更深入地研究龙利叶多酚的性质及应用提供更坚实的试验参考依据。

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Optimization of Extraction Conditions and Antioxidant Activities of Polyphenols from Sauropus rostratus Miq.

ZHANG Subin,ZHANG Xin,LI Min

(School of Chemistry and Chemical Engineering,Zhaoqing University,Zhaoqing 526061,China)

Based on single factor test,extraction conditions of polyphenols fromSauropusrostratusMiq.were optimized by orthogonal test,and antioxidant activities of the polyphenols were investigated to provide scientific basis for the development and application of the polyphenols.Ethanol was used for polyphenols extraction.The factors such as ethanol concentration,solid-liquid ratio,extraction temperature,time and extraction times were studied.The optimum extraction conditions were obtained by orthogonal experiment and determined as follows:60% ethanol,solid-liquid ratio of 1∶30,60 ℃,30 min and the extraction rate of polyphenols fromSauropusrostratusMiq.was 4.38 mg/g.The 50% inhibition concentrations(IC50) of polyphenols fromSauropusrostratusMiq.and ascorbic acid were 1.91 g/mL and 6.75 g/mL respectively for scavenging DPPH·.Reducing power was determined, and concentrations of polyphenols extracted and ascorbic acid were 9.94 g/mL and 32.06 g/mL respectively with absorbance of 0.5.Results showed that free radical scavenging activities on DPPH· and reducing power of polyphenols fromSauropusrostratusMiq.were better than those of ascorbic acid.

SauropusrostratusMiq.; polyphenols; extraction; orthogonal test; antioxidant activities

2016-08-11

广东省高等学校优秀青年教师培养计划项目(Yq2013164)；肇庆市科技创新计划项目(2014G22)

张素斌(1972-)，女，广东信宜人，讲师，硕士，主要从事天然产物分析研究。E-mail:zqzsb707@163.com

S567

A

1004-3268(2017)02-0148-05